2.2.3.Питательные среды для культивирования клеток и тканей.

В отличие от культивирования одноклеточных микроорганизмов, культивирование клеток и тканей требует для своего нормального протекания значительно более сложные по составу питательные среды. Общее число компонентов может варьироваться от нескольких десятков, до нескольких сотен. Помимо углеводов (глюкоза, сахароза) в их число входят различные соли (источники азота, фосфора, микроэлементов), различные аминокислоты, витамины, антибиотики (для поддержания стерильности). В средах для культивирования клеток растений обязательно присутствие различных фитогормонов и факторов роста. Среды для культивирования клеток животных и человека требуют добавки эмбриональной сыворотки, получаемой от эмбрионов или новорожденных телят. Из сыворотки выделено более 30 компонентов (факторов) в основном белковой природы, необходимых для поддержания нормального клеточного роста, и в частности прикрепления клеток к поверхности, однако вопрос о количестве и природе этих факторов до настоящего времени окончательно не решен.

Варьируя в ростовой и продукционной стадиях (трофофазе и идиофазе) состав питательной среды, в частности соотношение легкоусваиваемых (глюкоза) и трудноусваиваемых углеводов (сахароза), добавляя на определенных этапах культивирования различные вещества (индукторы, стрессовые факторы), можно существенно повысить выход целевых продуктов-метаболитов или вызвать синтез веществ, образование которых в нормальных условиях не происходит. Так для многих культур растительных клеток было показано, что увеличение в продукционной стадии концентрации основного питательного компонента – сахарозы в несколько раз вызывает значительное увеличение выхода целевого вторичного метаболита, т.е. сахароза выступает в роли индуктора. Положительное влияние на выход вторичных метаболитов оказывает и изменение соотношения количеств источников азота и фосфора (солей) и других микроэлементов в ростовых и продукционных питательных средах.

2.2.4.Асептика

Культуры животных и растительных клеток предъявляют очень высокие требования к стерильности питательных сред и наличию в них различных токсичных веществ.

“Дикие” микроорганизмы, которые мо­гут попасть в такую “богатую”питательную среду очень быстро вытеснят растительные или животные клетки, кроме того, токсины, которые они выделяют, могут ингибировать рост клеток или вызывать гибель культуры. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар - боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика дос­тигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направ­ленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептичес­кие комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую по­верхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.

Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фоль­гу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушиль­ном шкафу при температуре 160°С в течение 1,5 - 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышен­ном давлении в течение 15 - 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их сле­дует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 "С.

Клетки в культуре требуют отсутствия в ростовой среде лю­бых токсических веществ. Вода, используемая для приготовления относительно небольших объемов питательных сред, должна быть вначале деионизирована, а затем перегнана в стеклянной посуде. Хранить такую воду следует в стеклянной или пластиковой посуде. В связи с потребностью для культивирования клеток больших количеств воды высокой степени чистоты разработаны высокоэффективные технологические процессы получения очищен­ной воды методами обессоливания, такими, как ультрафильтра­ция, ионный обмен, обратный осмос, электролиз. Для культур клеток используется высокоочищенная вода, обычно получаемая комбинацией нескольких методов, например, электродиализа и ионного обмена, ионирования и дистилляции. Большое распространение получили мембранные методы очистки воды, которые от­личаются высокой эффективностью и экономичностью. Так ком­пактные уста-новки Ulttipoie, (США) обеспечивают полную очистку воды и постоянный контроль за ее качеством.

Антибиотики вводятся в состав питательных сред для подав­ления бактериальной инфекции. Однако, использование антибиоти­ков при культивировании клеток целесообразно только в случае кратковременных культур, а постоянное пассирование (пересев) клеточных линий должно проводиться в отсутствие антибиотиков, чтобы не способствовать отбору устойчивых к антибиотикам штаммов бакте­рий.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источ­ником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерили­зация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант (образец ткани для культивирования), промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем раство­ре их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скаль­пелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.

Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной тка­ни. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тро­пических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхност­ной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, ко­торые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, одна­ко, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к сте­рилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направ­ленно действующий антибиотик.