1.4.Идентификация гибридных клеточных линий, секретирующих специфические антитела

Теперь необходимо идентифицировать гибрид­ные клетки, вырабатывающие специфические антитела к им­мунизирующему антигену. Для этого обычно проводят скрининг культуральных сред, содер­жащих секретирующие антитела гибридомные клетки. Среду из тех лунок, в которых есть такие растущие клетки, отбира­ют и переносят в лунки другой микротитровальной плашки, предварительно покрытые слоем молекул антигена-мишени. Если в культуральной среде находится антитело (первое антите­ло), распознающее один из эпитопов данного антигена, то оно свяжется с антигеном и оста­нется в лунках после их промывания. Затем в лунки добавляют второе антитело, специфич­ное к мышиным антителам. Оно будет присое­диняться к любому первому антителу, связан­ному с антигеном.

К используемому в иммунном анализе второ­му антителу предварительно присоединяют фермент, который превращает неокрашенный субстрат в окрашенное соединение. Изменение цвета содержимого одной из лунок говорит о том, что исходная культуральная среда содержа­ла антитело, специфичное к данному антигену (рис.2). Если же такое антитело в среде отсут­ствовало, то второму антителу не с чем будет связываться и оно смоется при втором промывании. Субстрат в таких лунках остается неокрашенным.

Лунки исходной микротитровальной плашки, среда из которых дает положительный иммунный ответ (изменение цвета), могут содержать смесь гибридом различного типа. Чтобы получить линии, происходящие от одной клетки (клоны), клеточную суспензию из таких лунок сильно разбавляют культуральной средой и высевают в другие лунки. После культивирования полученных клонов среды вновь тестируют, определяя, какая из клеточных линий (гибридом) продуцирует моноклональные антитела, распознающие анти­ген-мишень. В том случае, когда получают более одной специфичной гибридомы, проводят даль­нейшие исследования, позволяющие опреде­лить, направлены ли антитела, вырабатываемые разными клонами, против одной и той же анти­генной детерминанты. Каждый клон, продуци­рующий моноклональное антитело, можно под­держивать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жид­ком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток.

Гибридомы, подобно большинству других кле­точных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела

очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике для создания иммунных сывороток или лекарственных препаратов. Чтобы решить эту проблему, предпринимаются попытки получения моноклональных антител на основе генетически модифи­цированных бактерий, растений и животных и прежде всего Е. coli.

1.5.Моноклональные антитела как лекарственные средства

Примерно 100 лет назад была предпринята попытка лечения людей, больных дифтерией, с помощью неочищенной антисыворотки, полученной от лошадей, которых инфицировали Corynebacterium diphtheriae, вызывающей дифте­рию у человека. С. diphtheriae инфицирует горло и миндалины, выделяя экзотоксин, приводя­щий к гибели клеток человека. Проникая в кро­воток, этот токсин поражает органы, удаленные от места первичной инфекции, и в отсутствие лечения болезнь может иметь летальный исход. (В те времена, о которых идет речь, смертность достигала 45%.) Однако, если больному в пер­вые несколько дней после начала инфекции ввести антисыворотку, полученную из крови лошади и содержащую антитела к этому экзотоксину, то у него возник­нет пассивный иммунитет, который позволяет избежать летального исхода.

К сожалению, риск, связанный с использова­нием антител, не позволяет широко применять этот метод терапии. Дело в том, что в организме больного часто вырабатываются собственные ан­титела на чужеродные белки, присутствующие в цельной или частично очищенной антисыворот­ке, и ее повторное введение в случае сенсибили­зации организма может привести к развитию анафилактического шока и гибели пациента.

С развитием гибридомной технологии вновь появилась надежда на то, что антитела можно будет широко использовать в качестве терапевтических средств. Однако при использовании моноклональных антител мыши остаются проблемы, связанные с риском развития перекрестных реакций, приводящих к развитию иммунного ответа и анафилаксии: ведь в организме больного могут вырабатываться соб­ственные антитела на детерминанты монокло­нальных антител мыши, пусть и не в такой степени как на поликлональные сыворотки. Поэтому основная проблема при создании иммунных сывороток и лекарств, в настоящее время, состоит в том, чтобы разработать высокоэффективные методы получения моноклональных антител человека, обладающих как специфиче­скими иммунотерапевтическими свойствами, так и пониженной иммуногенностью.

Получение препаратов специфических антител человека, не вызыва­ющих перекрестных реакций, путем традиционной гибридомной технологии представляет собой довольно трудную задачу, поскольку сталкивается с рядом проблем.

1. Пока не удается получить длительно культивируемые кле­точные линии миеломы человека, что не позволяет создать гибридомы с β-лимфоцитами человека, сопоставимые по эффективности с гибридомами, полученными из клеток мыши.

2. Хромосомы человека в гибридомах, полученных слиянием лимфоцитов человека с клетками миеломы мыши, нестабильны, поэтому труд­но получить клетки, способные вырабаты­вать моноклональные антитела человека.

3. Иммунизация человека различными антиге­нами не проводится по соображениям этиче­ского характера.

Таким образом, для получения антител чело­века необходимо разрабатывать другие подходы.

В одной из схем β-лимфоциты человека, ак­тивно продуцирующие специфические антитела, обработали in vitro флуоресцентно меченным антиге­ном, затем с помощью специального устройства - клеточного сортера прове­ли обогащение образца β-лимфоцитами, выраба­тывающими антитела к этому антигену. Поскольку β-клетки не растут в культуре, их предварительно трансформировали онковирусом Эпштейна-Барра. Некоторые клоны трансформированных β-клеток вырабатывают моноклональные антитела че­ловека, взаимодействующие с селективирующим антигеном. К сожалению, выход моноклональных антител был очень небольшим и они облада­ли низкой антигенсвязывающей активностью. К тому же вероятность того, что в неиммунизированном организме найдутся секретирующие антитела клетки, которые будут распознавать селективирующий антиген, очень мала.

Еще один подход заключается во введении иммунных клеток человека мутантным мышам, которые практически лишены собственной им­мунной системы (scid-мыиш). После трансплантации иммун­ных стволовых клеток человека таким мышам они приобретают клетки им­мунной системы человека и в ответ на введение антигена могут вырабатывать антитела человека.

Предпринимаются попытки ввести зароды­шам мышей гены иммуноглобулинов человека с целью создания трансгенных мышей, которые в ответ на иммунизацию конкретным антигеном смогут вырабатывать иммуноглобулины челове­ка. Чтобы получить от трансгенных животных клетки, секретирующие специфические моноклональные антитела, можно использовать стандартную гибридомную технологию, затем провести скрининг таких положительных кле­точных линий и определить, какие из них выра­батывают антитела, кодируемые генами имму­ноглобулинов человека. Недавно появилось сообщение о том, что уже получена трансгенная мышь, экспрессирующая нативные формы Н- и L-цепей иммуноглобулинов человека.

Трансплантация стволовых клеток иммун­ной системы человека scid -мышам и получение линий трансгенных мышей - весьма трудоем­кие и дорогие способы производства моноклональных ан­тител человека. Поэтому ученые пытаются соз­дать иные, альтернативные методы получения антител человека или их аналогов, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффек­тивных бифункциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушать ее.

Одним из наиболее перспективных подходов является создание и получение гибридных (химерных) моноклональных антител человека и мыши.

Тот факт, что разные участки молекулы имму­ноглобулина выполняют разные функции, позво­ляет генноинженерным путем модифицировать моноклональное антитело мыши. Эта модификация заключается в замене отдельных вспомогательных участков (сегментов) мышиного антитела на аналогичные по функциям участки антитела человека. Антигенсвязывающий участок от мышиного антитела при этом остается неизменным. Такие гибридные или как их еще называют химерные или гуманизированные антитела обладают значительно меньшей иммуногенностью для человека, сохраняя в то же время свою высокую антигеносвязывающую специфичность.

Так в одной из первых работ в этой области химерные антитела, несущие антигенсвязывающий участок моноклонального антитела мы­ши к поверхностному антигену клеток рака тол­стой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой и прямой кишки. Антитела оста­вались в кровотоке примерно в шесть раз доль­ше обычных антител мыши, тем самым, оказы­вая свое действие в течение большего времени. При этом лишь у одного пациента из 10 наблю­дался слабо выраженный иммунный ответ. К со­жалению, в этих испытаниях не удалось полу­чить противоопухолевого эффекта антител; возможно, это было связано с введением их в слишком малых дозах или с тем, что раковый процесс находился на поздних стадиях. В то же время в опы­тах in vitro эти химерные антитела проявляли высо­кую активность, что указывало на перспективность данного подхода к терапии рака. В последующие годы начался взрывной рост исследований и разработок в этой области. К настоящему времени уже одобрено к клиническому применению целый ряд высокоэффективных противораковых препаратов на основе гумманизированных моноклональных антител (Герцептин, Мабтера, Кампат, Цетуксимаб, Авастин и др.) и несколько десятков препаратов находятся на различных стадиях клинических испытаний. Производство препаратов на основе моноклональных антител останется в ближайшем будущем одним из самых быстрорастущих сегментов фармацевтического рынка. Помимо онкологии антитела используют также в трансплантологии, для лечения сердечно-сосудистых, аутоиммунных и инфекционных заболеваний. На мировом фармацевтическом рынке антитела занимают второе место по объёму производства после вакцин. По итогам 2006 года общий объем продаж этой группы препаратов составил около $20 млрд., а среднегодовые темпы роста продаж антител, как предполагается, составят в ближайшие пять лет не менее 14%.