Лекция №11 Оптимизация экспрессии клонированных генов.

Успешное осуществление процедуры клонирования чужеродного гена в нужном организме - хозяине еще не означает, что этот ген обязательно будет эффективно экспрессирован. Это обусловлено тем, что, обычно, кодируемый этим геном белок не только не нужен клетке, но и дополнительно требует для своего синтеза энергию (АТФ) и различные метаболиты (аминокислоты, азотистые основания, моносахариды и т.д.), что замедляет или даже нарушает процессы нормального клеточного метаболизма. В то же время, чтобы получение целевого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким.

Поэтому подбор оптимальных условий для эффективной экспрессии (транскрипции и трансляции) клонируемого гена является одной из ключевых операций генетической инженерии.

Никакой универсальной стратегии оптимизации экспрессии клонирован-ных генов не существует. Большинство таких генов имеют уникальные молеку-лярные свойства, и оптимальные системы экспрессии для каждого из них приходится подбирать индивидуально. Эффективность экспрессии любого чужеродного гена существенно зависит от степени родства организма донора ДНК с организмом хозяином. Несмотря на то, что многие представители как про-, так и эукариотических организмов способны к экспрессии чужеродных генов, для получения важных в коммерческом отношении продуктов с помощью технологии рекомбинантных ДНК ис­пользуют в основном Escherichia coli. Это связа­но, прежде всего, с тем, что сейчас достаточно хорошо изучены многие генетические, молекулярно-биологические, биохимические и физиологические свойства этого микроорганиз­ма. Кроме того, он достаточно хорошо культивируется в обычных условиях на дешевых и простых питательных средах и является безопасным в обращении. Помимо Escherichia coli для экспрессии некоторых клониро­ванных генов используются и другие организ­мы-хозяева: В. subtilis, дрожжи, животные, рас­тения и т. д., хотя стратегии, разработанные для Е. соli-систем, в принципе применимы и в этих случаях.

Экспрессия генов при участии сильных регулируемых промоторов

Для эффективной экспрессии любого гена со­вершенно необходимо наличие сильного промотора, расположенного перед данным геном. Такой промотор имеет высокое сродство к РНК-полимеразе, поэтому прилега­ющие к нему последовательности эффективно (с высокой частотой) транскрибируются. Поэтому на первый взгляд может показаться, что наиболее подходящим условием для экспрессии клонированного гена является встраивание его в плазмиду так, чтобы он находился под контролем такого постоянно функционирующего сильного про­мотора. Однако непрерывная экспрессия чуже­родного гена может оказаться гибельной для клетки-хозяина, поскольку приводит к истоще­нию ее энергетических ресурсов и нарушению метаболизма. Такие клетки будут очень медленно размножаться или вообще не будут делиться. Кроме того, плазмиды, несущие постоянно (конститутивно) экспрессирующийся чужеродный ген, нередко утрачиваются после нескольких клеточных циклов, поскольку не содержащие их клетки (или клетки содержащие меньшее их количество) растут быстрее и со временем становятся в культуре преобладающими. Нестабильность плазмид (утрата плазмид) - это основная проблема, мешающая получению продукта, локализованного в генах плазмид, в значительных количествах. Для ее решения нужно научиться контролировать экс­прессию и управлять ей таким образом, чтобы клонированный ген экспрессировался только в определенной фазе роста клеточной культуры (конец log –фазы, const –фаза) и только в течение опре­деленного времени, а для этого нужно использо­вать не просто сильные, а сильные регулируемые промоторы. Плазмиды, сконструированные для этих целей, называются экспрессирующими векторами.