Іі Генодіагностика інфекційних хвороб.

Основу генодіагностіки інфекційних хвороб становлять молекулярні методи досліджень, спрямовані на виявлення генетичного матеріалу (генів) збудників інфекцій - бактерій, вірусів, паразитарних агентів, найпростіших, рикетсій тощо. Найкращим методом генодіагностікі вважається полімеразна ланцюгова реакція.

Найважливішою перевагою ПЛР перед іншими методами, в тому числі молекулярно-біологічними, є її висока чутливість, що дозволяє визначати одиничні молекули інфекційних патогенів. Завдяки цьому за допомогою ПЛР можна діагностувати не тільки гострі інфекції, що супроводжуються присутністю в інфікованому організмі великої кількості збудників, але й хронічні та латентні інфекції, а також захворювання зі стертою, нетиповою клінічною картиною. До числа інших достоїнств ПЛР слід віднести високу специфічність досліджень (точність у виявленні шуканого генетичного матеріалу), а також можливість виявлення збудників в досить короткі терміни (в залежності від цілей - від 6 до 48 год).

В якості досліджуваного матеріалу для ПЛР-діагностики можуть використовуватися будь-які біологічні рідини, тканини і клітини: кров, плазма та сироватка крові, лейкоцити, ліквор, слина, слізна рідина, сеча, мазки, зіскрібки, сперма, секрет передміхурової залози, біоптати, аутоптати ( навіть ув'язнені в парафін), мокрота, фекальні екстракти та ін.. Вибір біологічного матеріалу для досліджень залежить від виду інфекції, яку діагностують, її локалізації, перебігу.

Спектр інфекційних захворювань, які можна успішно діагностувати за допомогою ПЛР, досить широкий: переважна більшість відомих бактеріальних, вірусних, протозойних, грибкових і паразитарних інфекцій. Найбільш актуальними для нашої країни є вірусні гепатити (А, В, С), інфекції сечостатевих органів (герпес, цитомегаловірусна інфекція, інфекції, викликані вірусом папіломи людини, хламідіоз, уреаплазмоз, трихомоніаз, мікоплазмоз, гонорея, сифіліс), кишкові інфекції (сальмонельози, дизентерія, ентеро-і ротавірусна), захворювання нервової системи (герпетичний, ентеровірусний, Західно-Нільський і кліщовий енцефаліт, серозні менінгіти та ін.)

Ііі Бактеріофаги та їх вплив на мінливість організму.

Бактеріофаг – це віруси, які паразитують на бактеріях та здатні спричинювати їх лізис. За своєю природою це живі організми, Вони здатні розмножуватися, змінюватися під впливом факторів навколишнього середовища, передавати у спадок свої властивості.

Фаги – дрібні частинки або корпускули, що мають голівку та хвіст

(відросток), по формі нагадують сперматозоїд. У деяких фагів відросток може бути відсутність. Розміри фагів 20-200 нм. Фаги, як і віруси, мають білкову оболонку та нуклеїнову кислоту, як правило ДНК двониткову.

Найбільш вивчена будова фагів кишкової палички. Вони мають голівку (кубічний тип симетрії) та відросток – жорстка порожня трубка, що має чехол з капсомерами спірального типу укладки. На кінці відростку є базальна пластинка з нитями.

Фаги більш стійкі до фізичних та хімічних факторів навколишнього середовища, ніж вегетативні форми бактерій, у яких вони розмножуються. Фаги витримують нагрівання до 75 град, заморожування, висушування, коливання рН від 5,0 до 8,5, не чутливі до антибіотиків, хлороформу, фенолу, етилового спирту.

Фаги мають властивість специфічності, тобто здатність розмножуватися та викликати лізіс бактерій певного типу чи виду.

Видові фаги – лізують культуру бактерій тільки одного виду.

Полівалентні фаги – викликають лізіс близьких видів бактерій, які належать до одного роду.

Типові фаги – лізують окремі штами або варіанти всередині одного й того ж виду бактерій.

Специфічність фагів використовують при лабораторній діагностиці інфекційних захворювань.

Озрізняють аги інфекційнй – здатні проникати у мікробну клітину, неінфекційні – перебувають у стадії розмноження.

Інфекційнй фаги в свою чергу поділяють на вірулентні – здатні репродукуватися в мікробній клітині та спричиняти її лізис, та помірні – здатні проникати в мікробну клітину й інтегрувати в її геном. Поза живою клітиною аги перебувають у стадії спокою.

Фаги, що викликають лізис бактерії – вірулентні.

Помірні фаги – фаги, що не руйнують бактерію, а тривалий час знаходяться у неї в латентному стані та розмножуються разом з бактеріальною клітиною.

Життєвий цикл фага може проявитися у формі продуктивної, дедуктивної та абортивної інфекції.

Продуктивну інфекцію спричинюють вірулентні фаги.

Взаємодія фагів та бактерій протікає у декілька фаз:

1 фаза – адсорбція фагу – фіксація фагу до клітинної стінки бактерії за допомогою відростка. Потім жорстка трубка циліндру проколює клітинну стінку бактерії та ДНК фагу проникає у цитоплазму бактерії крізь отвір.

До однієї бактерії може адсорбуватися значна кількість фагів.

2 фаза – латентний період – його тривалість досить різна.

3 фаза – період утворення нового фагу – фагова ДНК пригнічує синтез речовин у бактеріальній клітині, починають в рибосомах бактерії синтезуватися білкі фага та фагові оболонки. Потім ДНК фага та його оболонка об’єднуються та утворюється зріла частинка фагу.

4 фаза – лізис клітини – наступає приблизно через 30 хв від першої фази.

Під час цієї фази утворюється певна кількість фагів бактерії – 20-200 фагів.

Редуктивну інфекцію спричинюють тільки помірні аги. Після потрапляння у бактеріальну клітину такий фаг вбудовується в геном клітини-господаря. В такому випадку його називають профаг.

Культури бактерій, що зберігають у хромосомі помірний фаг, називають лізогенними.

Передача фагів спадково може припинитися під дією УФО, радіації, деяких антибіотиків, аскорбінової кислоти. В такому випадку помірні фаги перетворюються у вірулентні.

При лізисі бактерії фаг може захопити частину генів хромосоми бактерії та перенести їх до хромосоми іншої бактерії. Таким чином фаг здійснює одну з генетичних рекомбінацій – трансдукцію, переносячи невеликі ділянки хромосоми від одного мікроорганізму до іншого.

При абортивній інфекції взаємодія бактерії з фагом може припинитися на будь-якій стадії його життєвого циклу і він гине.

Поширення фагів у природі досить високе: стічні води, грунти, випорожнення людей та тварин, слиз із зіву, носу, шкіряних покривів людини, виділення з ран, сеча, кров.

Практичне застосування бактеріофагу.

1 фагодіагностика – додатковий метод визначення виду та типу мікроба, що викликав захворювання. В основі полягає специфічність фагу до збудників захворювання. При посіві «газоном» на поживному середовищи фаги лізують бактерії до яких вони специфічні та утворюють «стерильні плями» - негативні колонії фага. Фаг засівають на поживне середовище одночасно з культурою мікробів ( тест - культура). Відсутність росту тест-культури свідчить про наявність фагу.

2 метод фаготипування дозволяє відокремити мікроорганізми одного й того ж виду на різні фаготипи, що використовується при виявлені джерела інфекції.

3 Реакцій наростання титру фагу використовується для діагностики інфекційної хвороби та визначення забруднення навколишнього середовища. Суть полягає у додаванні у досліджуємий матеріал певної кількості фагів, якщо збудник у матеріалі відповідає фагу, то титр фагів збільшується.

4 специфічна профілактика та лікування здійснюється при черевно-тифозній та дизентерійній інфекції. Особливо ефективне застосування фагу з антибіотиками.

Бактеріофаг є потужним чинником мінливості бактерії. Їх використовують для отримання живих вакцин, передачі антигенних властивостей від одних бактерій до інших (властивість утворювати токсини, рухливість бактерій).