Итоговое занятие № 4.

1. Принципы и современная классификация вирусов.

Вирусы – это простейшие неклеточные формы жизни с облигатным внутриклеточным паразитизмом; состоящие из белковой оболочки, экранирующей снаружи геном, представленный молекулой только одного из типов нуклеиновых кислот (РНК или ДНК); не обладающие автономными метаболическими системами и размножающиеся путём многократного копирования своего генома с последующей его и белков оболочки сборкой за счёт пластических и энергетических ресурсов клетки-хозяина.

Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Явл. облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке отдельно синтезируются нуклеиновые к-ты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

В основу классификации вирусов положены следующие категории:

• тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, количество нитей;

• размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;

• наличие суперкапсида;

• чувствительность к эфиру и дезоксихолату;

• место размножения в клетке;

• антигенные свойства и пр.

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии,т.к. их размеры малы (18-400 нм).

По формам вирионы мб: палочковидные, пулевидные(вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиелита, ВИЧ), нитевидной, в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.

Простые, или безоболочечные, вирусы состоят из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.

Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены липопротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболочка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный М-белок.

Тип симметрии. Капсид может иметь спиральный, кубический или сложный тип симметрии. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида.

2. Вирион. Ультраструктура, химический состав, типы симметрии капсида.

Вирио́н — полноценная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и капсида (оболочки, состоящей из белка и, реже, липидов) и находящаяся вне живой клетки.

Размеры вирионов различных вирусов варьируют в широких пределах: от 15—18 до 300—400 нм. Они имеют разнообразную форму: палочковидную, нитевидную, сферическую, форму параллелепипеда, сперматозоидную.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называются сердцевиной.

Тип симметрии

Спиральная симметрия. В нуклеокапсиде взаимодействие нуклеиновой кислоты и белка осуществляется по одной оси вращения. Организация по принципу спиральной симметрии придаёт вирусам палочковидную форму. При спиральной симметрии белковый чехол лучше защищает наследственную информацию, но требует большого количества белка, так как покрытие состоит из сравнительно крупных блоков.

Кубическая симметрия.У подобных вирусов нуклеиновая кислота окружена капсомерами, образующими фигуру икосаэдра – многогранника с 12 вершинами, 20 треугольными гранями и 30 углами. Организация по принципу кубической симметрии придаёт вирусам сферическую форму. Принцип кубической симметрии – самый экономичный для формирования замкнутого капсида, т.к. для его организации используются сравнительно небольшие белковые блоки, образующие большое внутреннее пространство, в которое свободно укладывается нуклеиновая кислота.

Двойная (смешанная) симметрия. Некоторые бактериофаги (вирусы бактерий) имеют двойную симметрию: головка организована по принципу кубической симметрии, отросток – по принципу спиральной симметрии.

Отсутствие постоянной симметрии. Для вирусов больших размеров характерно отсутствие постоянной симметрии.

Химический состав канонических и неканонических вирусов.

Химический состав вирусов определяется их строением и типом генома. Вирионы сложных канонических вирусов в своем составе имеют все основные классы органических веществ: один из типов нуклеиновых кислот, белки, липиды, углеводы. Простые канонические вирусы, а также вирусоиды, липидов и углеводов не содержат и являются нуклеопротеидами. Только из нуклеиновых кислот (РНК или ДНК) состоят вироиды и плазмиды. Исключительно белковую природу имеют прионы.

Изучению химического состава вирусов предшествует их предварительная очистка от клеточного детрита. Для этого используются центрифугирование, осаждение солями и спиртами, фильтрация через софадекс-гели, адсорбция на ионообменных смолах с последующей элюцией. С целью проверки степени чистоты вирусов применяют различные методы фракционирования. Их сущность состоит в том, что вирусы физическими или химическими методами разделяют на несколько фракций, каждая из которых в последующем подвергается химическому анализу. Деструкция вирионов проводится кислотами, щелочами, детергентами, а также путём высаливания сульфатом аммония и спиртами. Фракционирование исследуемого материала осуществляют методами электрофореза, хроматографии, центрифугирования при различных значениях рН или с использованием ионообменных смол. Для качественного и количественного анализа, наряду с рутинными биохимическими исследованиями, применяются фотоэлектрокалориметрические, спектрофотометрические методы, ядерно-магнитный резонанс.

Нуклеиновые кислоты. Процентное отношение нуклеиновых кислот к весу вириона у разных вирусов колеблется в широких пределах, от 1 % у вируса гриппа А, до 50 % у бактериофага Т2. В частности, содержание ДНК в вирионе вируса герпеса составляет 3,8 %, полиомавируса – 12 %, аденовируса – 13 %, вируса полиомиелита – 26 %.

Молекулярная масса РНК-геномов колеблется от 0,2_*10⁶ кДальтон у рео- и ортомиксовирусов до 7_*10⁶ кДальтон у ретровирусов. У патогенных для человека ДНК-вирусов геномы имеют молекулярную массу от 1,5_*10⁶ кДальтон (парвовирусы) до 130_*10⁶ кДальтон (герпесвирусы). У отдельных иридовирусов масса молекулы ДНК может составлять 250_*10⁶ кДальтон. Молекулярные массы геномов вирусов в 10-100 раз меньше массы бактериальной ДНК, а по сравнению с ДНК эукариот – в 1000-10000 раз.

Вирусные нуклеиновые кислоты имеют одинаковый состав азотистых оснований с нуклеиновыми кислотами бактерий и эукариот. У РНК-вирусов среднее количество аденина составляет 26,6 %, урацила – 26,4 %, гуанина – 23,3 %, цитозина – 23,8 %. В составе генома ДНК-вирусов в среднем находится 23,5 % аденина, 26,4 % - гуанина, 23,3 % - тиамина и 25,5 % - цитозина. Количество пуриновых и пиримидиновых оснований у разных вирусов может колебаться в широких пределах. Например, содержание гуанина и цитозина в составе ДНК варьирует от 36 % у поксвирусов до 70 % у герпесвирусов. В составе вирусных нуклеиновых кислот можно обнаружить компоненты, которые отсутствуют у более высокоорганизованных существ (5-оксиметилцитозин, 5-оксиметилурацил, дезоксиуридиновая кислота). Нуклеиновые кислоты вирусов инактивируются под действием нуклеаз (РНКаза, ДНКаза) и высоких температур.

Белки вирусов состоят из 16-20 L-аминокислот и не имеют принципиальных различий с белками других организмов. Индивидуальность вирусных белков определяется аминокислотным составом, а также вторичной и третичной структурой. Процентное отношение белков к массе вириона может составлять от 49 % (вирус русского весенне-летнего энцефалита) до 89 % (вирус осповакцины).

Белки вирусов подразделяются на структурные и функциональные.

Структурные белки входят в состав суперкапсида, капсида и генома. По сравнению с бактериями и эукариотами количество структурных белков у вирусов незначительно и составляет от 1 (вирус табачной мозаики) до 20-30 у поксвирусов. У бактерий насчитывается несколько сотен белков, а у эукариот – несколько тысяч.

Молекулярная масса структурных белков наиболее часто находится в пределах 17-22_*10³ Дальтон, что соответствует примерно 200-300 аминокислотным остаткам. У вирусов растений молекулярная масса белков может достигать 47-70_*10³ Дальтон.

Структурные белки подразделяются на 3 группы: суперкапсидные, капсидные и геномные.

Суперкапсидные белки, или пепломеры, локализованы в суперкапсиде сложных вирусов и являются типичными мембранными белками. Они пронизывают липидный бислой суперкапсида насквозь, либо же погружены в него частично. Суперкапсидные белки имеют следующие особенности: 1) белки обычно гликолизированы (соединены в различных участках с углеводами разной длины и состава) или липидозилированы; 2) белки амфипатичны (имеют наружную гидрофильную часть, которая содержит на конце аминогруппу (N-конец), и погружённую в липидный бислой гидрофобную часть, содержащую гидроксильную группу (С-конец); 3) белки поверхностно-активны (участвуют в образовании адгезинов, выполняющих функцию рецепторов и способствующих слиянию вирусной и клеточной мембран при проникновении вириона в клетку); 4) белки антигенны и иммуногенны. Суперкапсидные белки – гемагглютинины – способны фиксировать эритроциты, что используется при индикации, идентификации и количественном выявлении вирусов.

Капсидные белки составляют протомеры – структурные компоненты капсомеров. Основной функцией капсидных белков является защита вирусного генома от неблагоприятных воздействий внешней среды. К особенностям этих белков относятся: 1) резистентность к действию протеаз бактериальных и эукариотических клеток, которая обусловлена маскированием С- и N-групп аминокислот полипептидных цепей; 2) идентичность белковых молекул, ведущая к экономии генетического материала вируса; 3) способность к самосборке; 4) антигенность и иммуногенность.

Геномные белки связаны с вирусной нуклеиновой кислотой. Это основные гистоноподобные белки, участвующие в образовании рибо- или дезоксирибонуклеопротеида. Они находятся внутри капсида и могут служить либо основанием, на которое накручивается нуклеиновая кислота вируса, например, у герпесвирусов, либо покрывают вирусную нуклеиновую кислоту снаружи. У пикорна-, папиллома-, полиома-, аденовирусов имеются белки, фиксирующие геном к капсиду. Это так называемые терминальные белки, ковалентно связанные с концом нуклеиновой кислоты. Функции геномных белков неразрывно связаны с функциями генома и их регуляцией. Геномные белки обладают определёнными антигенными свойствами.

Функциональные белки или ферменты вирусов весьма немногочисленны, поскольку собственных метаболических систем вирусы не имеют. При размножении вирусами преимущественно используется ферментативный аппарат клетки-хозяина. Вместе с тем, у многих вирусов имеются ферменты. По происхождению ферменты делятся на вирусные и клеточные, модифицированные вирусами.

Клеточные ферменты включаются в состав вирионов при прохождении их через клеточную мембрану. К клеточным ферментам, модифицированным вирусами, относится, например, АТФаза вируса герпеса, обладающая активностью выше таковой у других известных фосфатаз. Клеточное происхождение фермента подтверждается тем, что, наряду с вирионами, обладающими АТФазой, встречаются вирионы, не содержащие этого фермента.

Вирусными ферментами называют такие ферменты, которые содержатся в вирионах в нативной или генетически закодированной форме. Среди вирусных ферментов различают вирионные и вирус-индуцированные.

Вирионные ферменты представлены молекулами «готовых» ферментов, локализованных внутри вириона или на его поверхности. Наружные вирионные ферменты (нейраминидаза орто- и парамиксовирусов, мурамидаза (лизоцим) и фосфатаза бактериофагов, лецитиназа и АТФаза) находятся на суперкапсиде сложных вирусов, или капсиде простых вирусов. Внутренние вирионные ферменты локализованы внутри капсида и могут быть представлены полимеразами, протеиназами, эндо- и экзонуклеазами, обратной транскриптазой.

Вирусиндуцированными называются те ферменты, информация о которых закодирована в вирусном геноме, а сами ферменты образуются вследствие его транскрипции и трансляции. К вирусиндуцированным ферментам относятся ДНК-полимераза герпес- и поксвирусов, РНК-полимераза тога-, пикорна-, ортомиксо- и парамиксовирусов.

По функциональному назначению вирусные ферменты подразделяются на 3 группы.

1. Ферменты проникновения вируса в клетку и выхода дочерних популяций (нейраминидаза, мурамидаза, АТФаза, лецитиназа, фосфатаза).

2. Ферменты, участвующие в репликации и транскрипции генома (РНК- и ДНК-полимеразы, обратная транскриптаза).

3. Ферменты, модифицирующие вирусные нуклеиновые кислоты и белки (ДНК- и РНК- экзо- и эндонуклеазы, ДНК-лигазы, протеазы).

Разнообразен механизм действия вирусных ферментов. Нейраминидаза отщепляет нейраминовую кислоту от мукопротеида клеточной оболочки, вследствие чего снижается рН мукоида и он становится чувствительным к протеолитическим ферментам. Мурамидаза (лизоцим) гидролизует пептидогликан клеточной стенки бактерий, расщепляя гликозидные связи между N-ацетилглюкозоамином и N-ацетилмурамовой кислотой. Лецитиназа разрушает холинфосфоглицериды клеточных мембран. ДНК-зависимая РНК-полимераза переносит генетическую информацию с вирусной ДНК на РНК; ДНК-полимераза обеспечивает копирование дочерних ДНК; обратная транскриптаза (РНК-зависимая ДНК-полимераза) осуществляет перевод генетической информации с РНК на ДНК. Транскрипцию с «-»-нити РНК обеспечивает вирусный фермент РНК-зависимая РНК-полимераза. РНК- и ДНК-нуклеазы нарезают полинуклеотидные нити РНК и ДНК дочерних вирусов на геномные фрагменты. Протеазы осуществляют расщепление больших молекул, образующихся после трансляции, на мелкие структурные и функциональные белки. Некоторые вирусы содержат эндонуклеазы и лигазы, обеспечивающие реализацию определённых этапов репродукции.

Липиды содержат исключительно сложные канонические вирусы, суперкапсид которых имеет липидный бислой. Процентное содержание липидов в вирионах может составлять 1,5-57 %. В частности, количество липидов у поксвирусов достигает 4 %, у ретро-, тога- и ортомиксовирусов – 35-37 %. Из общего количества вирусных липидов 11-60 % приходится на фосфолипиды, 20-30 % - на холестерин. Фракция жирных кислот представлена пальмитиновой, стеариновой, олеиновой и линолевой кислотами. Нередко липиды образуют комплексы с белками (липопротеиды).

Липиды вирусов имеют клеточное происхождение. Они обволакивают вирионы при выходе их из клетки путём почкования (выпячивания клеточной мембраны). В связи с этим, нейтральные, фосфо- и гликолипиды сложных вирусов идентичны таковым клетки-хозяина. Основная функция липидов – стабилизация структуры вириона. Разрушение эфиром и другими детергентами липидной оболочки вирусов ведёт к их инактивации.

Углеводы могут составлять 2-16 % от массы вириона. Значительная часть углеводов пентозного ряда входит в состав нуклеиновых кислот в виде рибозы и дезоксирибозы. Гексозы и пентозы образуют также комплексы с белками и липидами. Гликопротеины имеют сахарные остатки сахарозы, маннозы, фруктозы, галактозы, гликозамина, нейраминовой кислоты. В составе гликолипидов углеводы выполняют каркасную функцию, сохраняют конформацию белковых молекул, защищают от действия протеаз. Как и липиды, углеводы суперкапсида имеют клеточное происхождение.

Вирусы могут содержать минеральные вещества (кальций, магний). Полагают, что они укрепляют структуру вирионов, обеспечивая соединение белка с нуклеиновой кислотой.