7.3.3. Биологический метод

Биологический метод заключается в заражении мокротой морских свинок, который очень чувствительны к МБТ. Данный метод требет всего 5 микробных тел в 1 мл для обнаружения збактерии, однако недостатки данного метода очевидны и он в настоящее время практически не применяется.

7.3.4. Исследование крови и мочи

[1, с.33-34]

7.3.5. Рентгенологические методы

Флюорография – традиционный массовый метод выявления туберкулёза. Его суть заключается в фотографировании изображения с рентгеновского экрана или с экрана электронно-оптического усилителя на фотоплёнку. Он позволяет обнаружить в лёгких гранулёмы и другие нарушения, вызванные деятельностью МБТ. В случае, если возникает подозрение на туберкулёз, проводятся дополнительные исследования, такие как рентгенография или томография. К сожалению, метод обычно не позволяет выявить нарушения на ранней стадии из-за относительно невысокой разрешающей способности. Недостатком метода также является отрицательное воздействие излучения на человека. Также данный метод требует специального дорогостоящего оборудования. [1]

7.3.6. Серологические методы

[Антиген-антитело]

7.3.7. Туберкулинодиагностика (тест Манту)

[1,54]

7.4. Решение задачи

В 2004 году биотехнологическая компания Cepheid объявила о создании новейшего метода определения туберкулёза Xpert MTB/RIF. Метод представляет собой полностью автоматизированный молекулярный тест с использованием картриджей. Метод основан на проведении полимеразной цепной реакции, а все необходимые для этого процессы (подготовка образца, амплификация генома и определение) проводятся в автоматическом режиме и не требуют участия специалистов. Каждый картридж сожержит в себе все необходимые компоненты для проведения реакции: лиофилизированные реагенты, буферные растворы, промывные растворы. Система обнаружения работает в режиме реального времени с использованием шестицветного лазерного (six-colour laser detection device) детектора.

Более того, метод позволяет не только определить наличие бактерии туберкулёза в пробе, но и исследовать её на рифампиновую устойчивость.

Новый метод детекции туберкулеза, позволяющий ускорить диагностику и определиться с методом лечения, был предложен доктором Катариной Боехм (Dr. Catharina Boehme) и ее коллегами. Исследования спонсировались Фондом Новейших Методов Диагностики (Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND)) и Университетом Медицины и Стоматологии штата Нью Джерси (the University of Medicine and Dentistry of New Jersey (UMDNJ)).

Суть метода заключается в предварительной обработке клинических образцов, а затем проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого образцы лизируются, ДНК изолируется и амплифицируется, а затем ампликон идентифицируется. Семигнездовая полимерзная цепная реакция в режиме реального времени амплифицирует специфическую последовательность гена rpoB (что за ген?), которая затем тестируется молекулярными маяками (molecular beacons) на мутации в районе устойчивости к рифампину.

Схематично процесс можно изобразить следующим образом (рис.1):

1. Образцы обрабатываются реагентом в соотношении 1:2. Смесь перемешивается и инкубируется в течении 15 минут при комнатной температуре, затем опять перемешивается.

2. 2 миллилитра смеси образца наносится на картридж.

3. Картридж вставляется в оборудование, дальнейшее участие человека для исследования не требуется.

4. Образец автоматически фильтруется и промывется.

5. Ультразвуковая обработка выделяет ДНК из смеси образца с реагентом.

6. ДНК перемешивается с сухими компонентами, необходимыми для полимеразной цепной реакции.

7. ДНК гена rpoB амплифицируется, затем проводится детекция молекулярными маяками.

8. Результаты сохраняются на компьютере и доступны для анализа.

Рис. 1

N-ацетил-цистеин и гидрохлорид натрия добавляются в образцы, вся смесь центрифугируется, затем осадок растворяется в 1.5 миллилитре фосфатного буфера. Секвенирование ДНК в обоих направлениях производится в процессе полимеразной цепной реакции на 81 нуклеотидах основного района гена rpoB ответственного за устойчивость к рифампину. Праймеры: CGTGGAGGCGATCACACCGCAGAC (прямой), AGCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT (обратный). Фрагмент амплифицируется используя готовый набор BigDye Terminator Cycle Sequencing kit на оборудовании 3130xl Genetic Analyzer.

Тест Xpert MTB/RIF является наиболее продвинутой технологией в области диагностики туберкулеза на сегодняшний день. В то же время он довольно прост в исполнении и позволяет проводить тестирование в любом уголке мира, где это наиболее необходимо. Кроме того, эта технология позволяет выявлять туберкулез у ВИЧ-инфицированных пациентов. Все стадии теста полностью автоматизированы. Экстракция, амплификация и детекция ДНК осуществляется автоматически в закрытом картридже, что минимизирует возможность загрязнения. Ручная работа сведена к минимуму, и результаты теста готовы менее чем за два часа. Более того, в процессе проведения теста не создается формирования инфекционных микрочастиц, что существенно для охраны здоровья лаборантов проводящих диагностику, а также обслуживаюго персонала.

Но, наряду с неоспоримыми достоинствами теста Xpert MTB/RIF существуют и недостатки. Во-первых, вполне возможно что метод потребует оптимизации и адаптации к условиям тестирования если он будет проводится в других условиях. Во-вторых, приложение современных супертехнологий увеличивает его себестоимость и не все страны третьего мира могут себе позволить его приобрести.

Низкая эффективность существующей диагностики туберкулеза и возрастающее по всему миру число пациентов с лекарственной устойчивостью требует новых быстрых и эффективных методов. Гланое достоинство теста Xpert MTB/RIF это легкость его проведения и возможность детекции нескольких разновидностей туберкулеза. Также, поскольку тест прост в исполнении, он не требует присутствия большого количества потенциально инфекционных туберкулезных палочек в образцах, а также отпадает необходимость в наличии кабинета-ламинара. Xpert MTB/RIF это самоокупаемый и высоко эффективный метод обнаружения туберкулеза и лекарственной устойчивости.

Метод Xpert MTB/RIF является наиболее продвинутым методом диагностики туберкулеза в настоящее время по ряду параметров. По мере развития экономики и инфраструктуры стран, где этот тест наиболее необходим, большее число лаборантов будет обучено этому методу, что приведет к его повсеместному распространению.