Точки начала репликации Saccharomyces cerevisiae
Установлено, что в удвоении полного генома дрожжей принимает участие более 400 точек начала репликации. Основное достижение в понимании механизма инициации репликации ДНК у Saccharomyces cerevisiae состояло в идентификации коротких (100-150 пар оснований) сегментов ДНК, которые действуют как точки начала репликации in vivo при их клонировании в дрожжевой плазмиде. Эти сегменты ДНК названные автономно реплицирующимися последовательностями (autonomously replicating sequences – или ARS-элементы) позволяют дрожжевым плазмидам несущим, например, ген-маркер ответственный за синтез одной из незаменимых аминокислот реплицироваться параллельно с клеточными хромосомами и тем самым обеспечивать рост дрожжевых клеток на селективной среде, не содержащей данной аминокислоты. Сразу после этого было доказано, что именно ARS-элементы, хотя и не все сразу являются истинными точками начала репликации в их естественном окружении в хромосомах. Репликация всегда начинается в пределах ARS-элементов, но не все ARS-элементы действуют как точки начала репликации ДНК в каждом клеточном цикле. Среднее расстояние между репликаторами у дрожжей составляет около 30.000 пар оснований при максимальной протяженности участков между соседними точками начала репликации, равной около 130.000 пар оснований. Даже этот самый протяженный участок должен быть легко реплицирован в течение 30 мин отведенных на S-фазу у дрожжей. Так как общее количество точек начала репликации заметно превосходит то количество, которое необходимое для удвоения дрожжевого генома в отведенный временной интервал, некоторые репликаторы активируются не в каждом клеточном цикле. Вероятность того, что каждая отдельная точка начала репликации будет активирована в конкретном клеточном цикле составляет от менее 0,2 до более 0,9. Более детальные исследования позволили установить, что ARS-элементы обладают двумя особенностями, делающими их точками начала репликации. Во-первых, любой ARS-элемент имеет консервативные последовательности, являющиеся связующими сайтами для особого белкового комплекса, который метит ARS-элемент как потенциальную точку начала репликации. Во-вторых, поблизости от указанных связующих сайтов присутствуют последовательности, в пределах которых можно легко вызвать плавление дуплекса ДНК, т.е. разделение пар оснований.
Более подробно, ARS-элементы обладают общей последовательностью ДНК, называемой основной (базовой) последовательностью ARS или ARS-кором (ARS core consensus sequence): 5/-(А/Т)ТТТАТ(А/G)ТТТ(А/Т)-3/. В свою очередь ARS-кор отличает важное свойство: одна единственная замена основания по некоторым положениям в пределах этой последовательности полностью инактивирует весь ARS-элемент. Другие менее консервативные последовательности в этом участке ДНК также влияют на активность ARS как точки начала репликации. Одна из них, обозначаемая В1, вместе с ARS-кором, формирует связующий сайт для комплекса из шести белков, названного комплексом узнавания точки начала репликации (origin recognition complex или ORC) (см. далее). Первичное разделение цепей ДНК необходимое для инициации репликации происходит в пределах другой короткой последовательности В2. Когда точка начала репликации действительно инициирует удвоение ДНК, синтез дочерних цепей начинается в сайте двунапраленной репликации (ТНДР) как раз посередине между ORC-связующим сайтом и В2-элементом .
Впервые комплекс белков ORC удалось идентифицировать благодаря его способности взаимодействовать с последовательностью ARS-кора, включающей 11 пар оснований. Это взаимодействие характеризуется двумя заслуживающими внимания особенностями. Во-первых, процесс взаимодействия ORC требует присутствия АТР, который остается связанным с комплексом ORC. Связывание АТР стабилизирует комплекс ORC, что позволяет ему принимать участие в последующих процессах сборки предрепликационных комплексов и инициации репликации ДНК. Во-вторых, у дрожжей комплекс ORC постоянно связан с точками начала репликации на протяжении всего клеточного цикла. Таким образом, что-то другое, а не присутствие ORC-комплекса должно участвовать в периодической активации точек начала репликации в S-фазе. У многоклеточных эукариот поведение ORC-комплекса является намного более сложным и изучено плохо.
Рис. 4.16 |
Структура элемента ARS1. Белковый комплекс ORC взаимодействует с последовательностью В1 и ARS-кором. Последовательность В2 представляет собой участок ответственный за разделение цепей материнской ДНК. Фактически синтез ДНК начинается в участке, обозначенном ТНДР (точка начала двунаправленной репликации). Последовательность В3 предназначена для связывания вспомогательного фактора ABF-1 являющегося как активатором транскрипции, так и активатором ARS-элементов (Pollard T.D., Earnshaw W.C., Cell Biology, Saunders, 2002). |
В типичных случаях ARS-элементы содержат дополнительные сайты связывания для других, специфичных к определенным ДНК-последовательностям белков, таких как факторы транскрипции. Например, элемент ARS1 включает последовательность В3, которая взаимодействует с фактором транскрипции ABF-1 (ARS-binding factor 1). Однако, как было установлено, делетирование ABF-1-связующего сайта лишь незначительно снижает способность ARS1 действовать в качестве репликатора in vivo. Более того, сам фактор ABF-1 может быть заменен некоторыми другими факторами транскрипции, путем делетирования последовательности В3 и вставки на ее место участка ДНК предназначенного для связывания другого фактора транскрипции. со своими последовательностями в ДНК на взаимодействие с последовательностью В3. В результате таких замен полученные искусственные ARS-элементы реплицируются с эффективностью такой же, как элементы дикого типа.
Оказалось, что между точками начала репликации и промоторными элементами, которые, как известно, ответственны за стимуляцию транскрипции генов, существуют важные функциональные взаимосвязи. В частности, в дополнение к установленной роли гексамерных комплексов ORC в репликации ДНК отдельные компоненты этих комплексов, по-видимому, принимают участие также и в регуляции транскрипции. Действительно, тесное взаимодействие между аппаратами транскрипции и репликации объясняет, почему те области хромосом, с которых активно транскрибируются гены, как правило, рано реплицируются в S-фазе.