Элонгация

Стадия элонгации в ходе репликации ДНК включает два различных, но взаимосвязанных процесса: синтез лидирующей цепи и синтез отстающей цепи. Определенный набор ферментов и вспомогательных белков, действующих в области репликативной вилки, является общим для синтеза обеих цепей. К ним относятся ДНК-геликазы, ДНК-топоизомеразы и SSB-белки. Так, ДНК-геликазы разделяют материнские цепи исходной ДНК, ДНК-топоизомеразы устраняют топологическое напряжение, генерируемое геликазами, а SSB-белки стабилизируют разделенные одиночные материнские цепи. Начиная с момента стабилизации разделенных одиночных материнских цепей, процессы синтеза лидирующей и отстающей дочерних цепей приобретают существенные различия.

Синтез лидирующей цепи начинается с образования в точке начала репликации короткого (10-60 нуклеотидов) РНК-праймера под действием праймазы – белка dnaG. Затем синтез лидирующей цепи происходит непрерывно путем добавления дезоксинуклеотидов к 3^/-концу праймера под действием ДНК-полимеразы III. В противоположность лидирующей цепи, синтез отстающей цепи осуществляется посредством периодического образования достаточно коротких ДНК-фрагментов, называемых фрагментами Оказаки. В этом случае сначала под действием праймазы также синтезируется РНК-праймер и ДНК-полимераза III начинает добавлять к нему дезоксинуклеотиды, синтезируя фрагмент Оказаки. При всей кажущейся простоте образования каждого отдельного фрагмента Оказаки в целом процесс синтеза ДНК требует решения важной «пространственной задачи» связанной с необходимостью преодоления проблемы антипараллельности цепей исходной молекулы и ее согласования с естественным свойством всех ДНК-полимераз – неспособностью данных ферментов присоединять нуклеотиды к 5^/-концам праймеров. Суть решения данной проблемы заключается в необходимости координации образования лидирующей и отстающей цепей. Действительно, синтез обеих цепей происходит с участием одного единственного (в одной репликативной вилке) асимметрического димера ДНК-полимеразы III, который обеспечивает сближение двух точек полимеризации. Такая ситуация может быть реализована в случае образования «петли» на отстающей цепи как это показано на рис. 3.

Рис. 3

Синтез лидирующей и отстающей цепей ДНК. События в области одной репликативной вилки скоординированы одним единственным асимметрическим димером ДНК-полимеразы III в комплексе с dnaB-геликазой. На рисунке показан уже происходящий процесс репликации. Отстающая цепь образует петлю и взаимодействует с ДНК-полимеразой III так, что синтез лидирующей и отстающей цепей происходит одновременно. Красной стрелкой показаны 3/-концы двух новых цепей и одновременно направление синтеза ДНК. Черные стрелки показывают направление движения родительской ДНК через полимеразный комплекс. Показано образование фрагментов Оказаки на отстающей цепи.

Синтез фрагментов Оказаки на отстающей цепи представляет собой в некоторой степени элегантную «ферментативную хореографию». Белки dnaВ-геликаза и dnaG-праймаза являются составными частями комплекса называемого праймосомой, который формируется вслед за образованием предзатравочного комплекса в результате связывания с dnaВ-геликазой белка dnaG-праймазы. Для осуществления репликации ДНК-полимераза III использует один набор субъединиц кор-фермента для непрерывного синтеза лидирующей цепи, тогда как другой набор субъединиц кор-фермента осуществляет циклическое образование фрагментов Оказаки. dnaВ-геликаза расплетает двойную спираль ДНК в репликативной вилке (рис. 3-а) по мере своего АТР-зависимого перемещения по отстающей цепи в направлении 5^/3^/. ДНК-праймаза время от времени связывается с dnaВ-геликазой и синтезирует короткий РНК-праймер (рис. 3-b). После этого новый «скользящий зажим», обозначаемый  позиционируется на праймере с помощью -комплекса ДНК-полимеразы III (рис. 3-c). По завершению синтеза фрагмента Оказаки репликация приостанавливается, и субъединицы кор-фермента ДНК-полимеразы отделяются от «скользящего зажима» (и от фрагмента Оказаки) и взаимодействуют с новым «скользящим зажимом» (рис. 3-d,e). Описанные выше события инициируют синтез следующего фрагмента Оказаки. В целом, весь набор ферментов, действующий в области репликативной вилки, называют реплисомой. Характеристика ферментов реплисомы приводится в табл. D.

Реплисома способна поддерживать высокую скорость синтеза ДНК, присоединяя около 1.000 нуклеотидов в сек к каждой растущей цепи. После образования фрагмента Оказаки тот РНК-праймер, который служил основой для его синтеза, удаляется под действием РНК-азы Н и пробел заполняется соответствующим участком ДНК с помощью ДНК-полимеразы I, а остающаяся брешь «залечивается» ДНК-лигазой.

ДНК-лигаза катализирует формирование фосфодиэфирной связи 3^/-гидроксильным концом одной цепи и 5^/-фосфатным концом другой. Лигазная реакция протекает только в том случае если 5^/-концевая фосфатная группа активирована аденилированием. Для этой цели вирусы и эукариоты используют АТР. В тоже время бактериальные ДНК-лигазы в большинстве случаев для активации 5^/-концевых фосфатных групп используют АМР являющийся компонентом NAD⁺. Кроме процесса репликации ДНК ДНК-лигазы также принимают участие в рекомбинации и репарации этой информационной молекулы, а также находят широкое применение в генно-инженерных работах при получении рекомбинантных ДНК.