Сборка предрепликационного комплекса

Для сохранения целостности генома каждая точка начала репликации должна активироваться («поджигаться») только один раз в ходе клеточного цикла. Хотя механизмы, лежащие в основе регуляции согласованной активации точек начала репликации в клеточном цикле эукариот не до конца понятны, определенные положительные результаты исследования данного процесса у дрожжей все же проливают некоторый свет на понимание принципов функционирования репликаторов.

Как указывалось ранее, дрожжевой комплекс узнавания точки начала репликации – ORC стабильно связан с точкой начала репликации в течение всего цикла дрожжевой клетки. При этом было установлено, что комплекс ORC не является «пусковым устройством» репликации ДНК. Скорее его можно рассматривать как некое «приспособление», на котором собирается белковый комплекс непосредственно ответственный за инициацию репликации ДНК. В течение поздней анафазы или очень ранней фазы G₁ с комплексом ORC в точке начала репликации связываются два белка обозначаемые Cdc6p и Cdt1. Образовавшийся тройной комплекс [ORC ·Cdc6p ·Cdt1] в свою очередь привлекает в точку начала репликации гексамерный комплекс белков Mcm и обеспечивает взаимодействие последнего с ДНК. Образовавшийся комплекс, состоящий из ORC, Cdc6p, Cdt1 и белков комплекса Mcm известен как предрепликационный комплекс (рис. 4.17А). Указанный предрепликационный комплекс собирается в каждой точке начала репликации до наступления фазы S.

Белки Mcm 2-7 формируют гексамерный комплекс, имеющий форму «хомута», который охватывает цепь ДНК. В настоящее время не вызывает сомнения, что гексамер Mcm выполняет функцию ДНК-геликазы – фермента, который используя энергию гидролиза АТР разделяет цепи материнской ДНК.

В настоящее время полагают, что именно сборка предрепликационного комплекса является тем ключевым моментом регуляции репликации, в котором каждая точка начала репликации «получает разрешение» («лицензируется») на инициацию удвоения ДНК так, что инициация происходит только однажды в каждом репликаторе в течение клеточного цикла. Это «лицензирование» реализуется, по крайней мере, посредством трех механизмов.

Первый из них включает регуляцию активности белка Cdc6p с участием киназ Cdk. Так, комплекс белков [Cdc6p·Cdt1] обеспечивает взаимодействие геликазы Mcm с точкой начала репликации в ДНК только в дефосфорилированном состоянии. Протеин-киназной активностью инактивирующей белок Cdc6p обладает фактор SPF (S phase promoting factor), который, как полагают, состоит из специфических пар циклинов Cdk. В клетках млекопитающих они включают Cdk1 или Cdk2 связанные попарно с циклинами Е, А и В; у дрожжей единственный циклин Cdk образует пары с циклинами семейства В-типа.

Второй механизм «лицензирования» точек начала репликации характерен для позвоночных и зависит от белка под названием геминин. Геминин не позволяет комплексу [Cdc6p·Cdt1] обеспечить присоединение белков Mcm к ДНК. В свою очередь белковый комплекс, обозначаемый APC/C способен разрушать геминин, поддерживая его концентрацию на очень низком уровне во время сборки предрепликативных комплексов. Накопление геминина, начинающееся в S-фазе, предотвращает сборку новых предрепликационных комплексов до того момента, пока не завершится фаза митоза. Интересно, что дрожжевые клетки утратили геминин, а, следовательно, и данный механизм «лицензирования».

Третий способ регуляции «лицензирования» точек начала репликации (после наступления S-фазы) заключается в механическом изолировании в цитоплазме белковых факторов необходимых для сборки репликационного комплекса. У дрожжей такими факторами, исключаемыми из ядер после инициации репликации, являются белки Mcm. У позвоночных одним из таких исключаемых факторов является белок Cdt1.