uchebnik

241

Методы микробиологической диагностики.

Для выявления ХИ используют различные диагностические методы:

•микроскопический;

•выделение возбудителя;

•серологические;

•методы иммуноиндикации;

•молекулярно-генетические методы.

Материалом для исследования могут быть соскобы столбчатого эпителия цервикального канала шейки матки и уретры, отделяемое глаз новорожденных или больных конъюнктивитом, соскобы из уретры мужчин, половые партнеры которых страдают воспалительными заболеваниями гениталий и др.

Микроскопический метод.

Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают по РомановскомуГимза и микроскопируют. В клетках обнаруживают элементарные тельца хламидий, которые окрашены в розовый цвет, и ретикулярные тельца голубого или синего цвета. Ядра клеток имеют вишневый оттенок.

Выделение возбудителя.

Выделение возбудителя в культуре клеток является эталонным методом диагностики. Он обладает высокой специфичностью. Однако, его использование ограничено.

Серологическая диагностика.

Для серологической диагностики ХИ используют различные реакции иммунитета. Чаще всего это реакция непрямой иммунофлюоресценции (НИФ), в том числе ее микрометод.

Иммуноиндикация.

Основным методом диагностике ХИ является иммунофлюоресценция (ПИФ) с использованием меченных ФИТЦ моноклональных антител против основного белка наружной мембраны хламидий.

Молекулярно-генетические методы.

Эти методы по чувствительности превосходят другие. Различные его модификации (ДНК-зонды, ПЦР) позволяют обнаружить в исследуемом материале нуклеотидные последовательности ДНК хламидий (но не самих возбудителей).

2. Мочеполовой трихомониаз.

Возбудителем мочеполового трихомониаза является Trichomonas vaginalis (влагалищная трихомонада). Это эукариот, одноклеточный достаточно сложно организованный паразит. Его тело состоит из оболочки, протопласта,

242

блефаропласта, аксостиля, четырех жгутиков, ундулирующей мембраны, фибрилл. В расширенной передней части трихомонад располагается удлиненное ядро с ядрышком и глыбками хроматина. В цитоплазме находятся пищеварительные вакуоли. Тело трихомонад, включая жгутики, покрыто трехслойной мембраной - перипластом. Размножаются трихомонады путем продольного деления. В естественных условиях обитает только в мочеполовом тракте человека. Местом обитания Trichomonas vaginalis является влагалище у женщин, предстательная железа и семенные пузырьки у мужчин. Вне организма трихомонады быстро теряют жизнеспособность. Их культивируют в анаэробных условиях на стандартных средах и в развивающихся куриных эмбрионах. При росте на жидких питательных средах влагалищные трихомонады дают придонный рост в виде плотного беловатого осадка.

В мочеполовых органах трихомонады вызывают развитие воспаления. Выделяемая ими гиалуронидаза разрыхляет ткани, что способствует свободному проникновению в межклеточные пространства как самих возбудителей, так и токсических продуктов их обмена, а также сопутствующей бактериальной флоры.

Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностики трихомониаза применяют различные методы:

•микроскопические;

•культуральные;

•серодиагностики;

•иммуноиндикации.

Микроскопическое исследование.

1. Микроскопия нативного препарата.

Материалом для исследования служит отделяемое или соскобы из

различных отделов мочеполовых путей. При микроскопии нативных неокрашенных препаратов влагалищные трихомонады видны как клетки грушевидной или овальной формы, размерами чуть больше лейкоцитов, с характерными толчкообразными движениями. При фазово-контрастной микроскопии хорошо видны жгутики.

2. Микроскопия окрашенного препарата.

В препаратах, окрашенных метиленовым синим или по Граму, трихомонады имеют овальную, округлую или грушевидную форму с хорошо выраженными контурами, компактным ядром и нежно ячеистой цитоплазмой.

3. Люминесцентная микроскопия.

Метод люминесцентной микроскопии основан на аутолюминесценции трихомонад в ультрафиолетовых лучах. При незначительной собственной люминесценции материала можно использовать окраску люминофорами (акридиновый оранжевый).

Культуральные методы.

243

Исследуемый материал (отделяемое влагалища, уретры, секрет простаты или сперма) засевают на специальные питательные среды, заражают им клетки культуры ткани или развивающиеся куриные эмбрионы. Посевы культивируют в анаэробных или микроаэрофильных условиях.

Серологическая диагностика.

Определение антител в сыворотке крови и секретах можно проводить с помощью РСК, РПГА, РИФ. Однако, диагностическая ценность обнаружения антител к трихомонадам невелика.

Иммуноиндикация.

В исследуемом материале с помощью латексных или эритроцитарных антительных диагностикумов выявляют растворимые антигены трихомонад. Метод особенно ценен для диагностики хронического трихомониаза и бессимптомного носительства.

3. Мочеполовой микоплазмоз и уреаплазмоз.

Возбудителями этих заболеваний являются Micoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Эти возбудители относятся к семейству Mycoplasmataceae, родам Mycoplasma и Ureaplasma.

Микоплазмы - это бактерии. Отличительной биологической особенностью представителей этого семейства является отсутствие у них ригидной клеточной стенки, вместо которой они покрыты трехслойной “объединяющей” мембраной, т.е. они имеют только одну липопротеиновую мембрану, выполняющую функции собственно цитоплазматической мембраны и клеточной стенки. Культура микоплазм состоит из “зрелых” (400-1400 нм) клеток и “элементарных” телец (100-250 нм). Последние могут находиться как внутри, так и вне “зрелых” клеток.

Микоплазмы отличаются выраженным полиморфизмом. Неподвижны. Спор и капсул не имеют. Грамотрицательны. Факультативные анаэробы.

Микоплазмы требовательны к питательным средам. Температура культивирования 370С.

На плотной питательной среде через 48-96 часов образуют характерные колонии, напоминающие яичницу глазунью - круглые с зернистой поверхностью и втянутым темным центром; плотно спаяны со средой. На жидких питательных средах дают легкое помутнение.

Признаком, позволяющим дифференцировать микоплазмы от уреплазм является способность последних гидролизовать мочевину, а также различия их антигенной структуры.

Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностики микоплазменной инфекции применяются следующие методы:

• бактериологическое исследование;

244

•серодиагностика;

•иммуноиндикация;

•молекулярно-генетические методы.

Бактериологическое исследование.

Оно является наиболее значимым методом лабораторной диагностики

мочеполового микоплазмоза и уреаплазмоза. У женщин материалом для исследования являются мазки или соскобы из уретры, канала шейки матки, больших вестибулярных желез, у мужчин - отделяемое уретры, первая порция мочи, секрет предстательной железы. Посев проводится на специальные питательные среды.

Серологическая диагностика.

Обнаружение антител в РСК, РПГА, ИФА используется при массовых обследованиях групп риска, а также для подтверждения клинического диагноза.

Иммуноиндикация.

Для выявления антигенов микоплазм и уреаплазм в патологическом материале и крови могут быть использованы ИФА, РИФ и другие современные методики.

Молекулярно-генетические методы.

Для обнаружения нуклеотидных последовательностей ДНК микоплазм и уреаплазм в соскобах из уретры, со стенок влагалища, цервикального канала и другом патологическом материале разработаны ДНК-зонды и праймеры для ПЦР.

4. Генитальный герпес.

Возбудитель полового герпеса относится к семейству Herpesviridae, вид Herpes simplex, второго серовара. Геном вируса представлен линейной двунитевой ДНК, которая намотана на центральный внутренний белок. Тип симметрии нуклеокапсида кубический. Культивируется в развивающихся куриных эмбрионах и культурах ткани с образованием гигантского многоядерного синтиция. Термолабилен, чувствителен к воздействию эфира и УФ лучей. Источник инфекции больной или носитель. Путь передачи возбудителя контактный, возможно транспланцентарное заражение плода.

Основное клиническое проявление - герпетические высыпания на слизистых оболочках половых органов. Генитальный герпес характеризуется рецидивирующим течением.

Методы микробиологической диагностики.

Для диагностики герпетической инфекции используются следующие методы:

•вирусологическое исследование;

•цитоморфологический метод;

245

•серодиагностику;

•методы иммуноиндикации;

•молекулярно-генетические методы.

Вирусологическое исследование.

Материал для исследования забирают из очагов поражения и после

соответствующей обработки заражают им развивающиеся куриные эмбрионы или культуру тканей. О размножении вируса судят по образованию “бляшек” на хорионалантоисной оболочке эмбрионов или цитопатическому действию (образование многоядерных клеток) в культуре ткани. Идентифицируют вирус в реакции вируснейтрализации.

Вирусологическое исследование имеет большое значение при бессимптомном и хроническом рецидивирующем течении инфекции.

Цитоморфологические исследования.

Материал - мазки отпечатки из очагов поражения, окрашенные по Романовскому-Гимза. В клетках наблюдается типичный для вируса герпеса метаморфоз клеток и ядер. Размер клеток увеличивается, в них обнаруживаются ядерные базофильные включения. Электронно-микроскопическое исследование позволяет обнаружить характерные по морфологии вирионы вируса герпеса.

Серодиагностика.

Для обнаружения в крови антител к антигену вируса простого герпеса 2 типа могут быть использованы РСК, РН, ИФА.

Иммуноиндикация.

Для обнаружения в крови и материале из очагов поражения антигена вируса простого герпеса типа 2 могут быть использованы РСК, РН, РПГА, ИФА, РИФ.

Молекулярно-генетические.

Для обнаружения нуклеотидных последовательностей ДНК вируса простого герпеса типа 2 разработаны тест-системы для реализации ПЦР.

5. Контагиозный моллюск гениталий.

Возбудитель этого заболевания - неклассифицированный ДНКсодержащий вирус из семейства Poxviridae, вид Molluscovirus hominis.

Основные клинические признаки: появление на коже телесного цвета, белых, полупрозрачных, желтых или красных узелков, располагающихся внизу живота, на лобке, внутренних поверхностях бедер, гениталиях. Поверхность их гладкая, в центре имеется углубление, из которого при надавливании выделяется масса беловатого цвета, состоящая из эпидермальных ороговевших клеток, жира и, так называемых, моллюсковых телец.

Возможно слияние элементов с образованием гигантских моллюсков размером 2-3 см.

246

Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностики используются микроскопический и серологический методы.

Микроскопическая диагностика.

При микроскопии окрашенных по Романовскому-Гимза мазков из содержимого узелков обнаруживают внутриклеточные базофильные включения, называемые “тельца моллюсков” или “тельца Гендерсона-Патерсона”.

Серологическая диагностика.

Для обнаружения антител в сыворотках обследуемых используют метод непрямой иммунофлюоресценции.

Профилактика ЗППП.

Каждый медицинский работник должен помнить следующее.

1.Специфической профилактики ЗППП нет.

2.Санитарное просвещение и информирование населения о ЗППП и их последствиях - вот основной путь их профилактики.

Большое значение имеют:

•активная работа с группами повышенного риска (проститутки, наркоманы, гомосексуалисты, женщины, страдающие хроническими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта неясной этиологии, беременные с осложненным акушерским анамнезом);

•выявление, обследование и лечение лиц, послуживших источником заражения;

•повышение степени доступности презервативов и их пропаганда;

•строгое соблюдение санитарно-гигиенических мероприятий (обеззараживание медицинского инструментария, обработка резиновых перчаток, используемых для вагинального исследования), исключающее распространение ЗППП в ЛПУ.

Задание.

1.Промикроскопировать мазки из гнойного отделяемого больного с диагнозом острая гонорея.

2.Промикроскопировать мазки от больных с подозрением на хламидиоз.

3.Учесть результаты Luis-теста (ИФА по обнаружению антител).

4.Поставить осадочную реакцию на сифилис (р.Кана).

247

Занятие 14. Тема: Микробиологическая диагностика вирусных инфекций.

Современная вирусология располагает широким набором методов диагностики вирусных инфекций. Это:

Вирусоскопическое исследование; Вирусологическое исследование; Методы серодиагностики; Методы Иммуноиндикации;

Молекулярно-генетические методы.

Выбор метода лабораторной диагностики определяется характером заболевания, периодом болезни и возможностями лаборатории.

1. Вирусоскопическое исследование.

Целью его является обнаружение при микроскопии исследуемого материала внутриклеточных включений, а в отдельных случаях при электронной микроскопии - вирионов.

Обнаружение включений Бабеша-Негри при оптической микроскопии патологического материала применяется, например, для диагностики бешенства. Для диагностики ротавирусной инфекции используют электронную микроскопию фекалий, при которой можно обнаружить типичные по морфологии вирионы.

2. Вирусологическое исследование.

Целью его является выделение вирусов и их идентификация. Этот метод является наиболее достоверным для доказательства этиологической природы заболевания. Вирусологическое исследование наиболее информативно.

Однако, необходимо помнить, что само по себе выделение вируса из организма даже больного человека не всегда может свидетельствовать о его этиологической роли. Только при тщательном сопоставлении с данными клиники, эпидемиологического анамнеза, результатами серологических реакций результаты вирусологического исследования приобретают соответствующее значение.

Это положение приобретает особенно большое значение в связи с наличием большого числа латентных и персистирующих вирусов.

Алгоритм вирусологического исследования.

I. Выделение вируса с помощью различных методов культивирования. II. Идентификация вируса до уровня: семейства, вида, внутривидовая.

I. Выделение вируса.

Для выделения вируса от больных могут быть использованы разные методы культивирования.

1.Культивирование в организме восприимчивых животных.

2.Культивирование в развивающихся куриных эмбрионах.

3.Культивирование в культуре ткани.

248

Наибольшее распространение получили первичнотрипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной тканей, клетки которых в виде монослоя прикрепляются к стенкам пробирок. Для поддержания жизнедеятельности клеток культуры ткани используют специальные питательные среды, содержащие полный набор веществ необходимых для роста клеток.

Первично-трипсинизированные культуры клеток готовят из эмбриональных тканей человека, кур, мышей. Эмбриональные ткани обладают большой потенцией к росту.

Перевиваемые культуры представляют собой штаммы клеток злокачественных опухолей (Hela, Нер-1, Нер-2, Детроит-6). Их рост поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей.

О размножении вируса в культуре ткани судят по следующим критериям.

1.Цитопатическое действие. Оно выражается в различных изменениях морфологии клеток, пикнозе ядер, образовании симпластов (гигантских многоядерных клеток), полной деструкции монослоя.

2.Внутриклеточные включения. Вирусы в зараженных клетках могут вызывать образование внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме или ядре пораженных клеток.

3.Метод цветной пробы. Клетки культуры ткани культивируют в питательной среде с индикатором. При росте незараженных клеток они образуют кислые продукты метаболизма, и индикатор меняет цвет питательной среды. Репродукция вируса в клетках культуры ткани нарушает метаболизм клеток, кислых продуктов не образуется, и цвет среды не изменяется.

4.Феномен гемадсорбции. На поверхности клеток, зараженных вирусами, синтезирующими гемагглютинин, экспрессируются значительные его количества, и эти клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты.

5.Феномен гемагглютинации. При размножении в культуре ткани гемагглютинирующих вирусов культуральная жидкость (в ней накапливаются новые вирионы) приобретает способность агглютинировать эритроциты.

6.Бляшки под агаром. На газоне однослойной культуры ткани, залитой агаром, формируются негативные колонии.

II. Идентификация выделенных вирусов.

Первичную идентификацию вируса до уровня семейства можно провести с помощью набора следующих тестов:

Определение типа НК - проба с бромдезоксиуридином; Определение наличия суперкапсидной оболочки - проба с эфиром;

Определение размеров вирионов - фильтрование через фильтры с диаметром пор 50 и 100 нм;

Синтез гемагглютинина - реакция гемагглютинации.

Оценку результатов проводят путем заражения культуры ткани пробой, подвергнутой соответствующей (1, 2, 3) обработке, с последующим учетом результатов заражения по цветной пробе.

249

Идентификация вируса до вида, внутривидовая идентификация может быть проведена разными методами. Чаще всего для этого используют реакцию вируснейтрализации с соответствующими иммунными противовирусными сыворотками. После обработки такими сыворотками вирусы теряют свою биологическую активность (нейтрализуются). Об этом судят по:

результатам РТГА; цветной пробе;

отсутствию цитопатического действия; выживаемости чувствительных животных;

отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов.

Для идентификации выделенных от больного вирусов могут быть использованы методы молекулярной гибридизации (МГ).

3. Серодиагностика.

Серодиагностика вирусных инфекций используется для обнаружения в сыворотке обследуемого АТ и нарастания их титра. Для этого используют различные реакции иммунитета, чаще всего это РСК, ИФА, РТГА. Реакции ставят с известными вирусными диагностикумами. Обязательно исследование парных сывороток для выявления нарастания титра инфекционных антител.

4. Иммуноиндикация.

Для иммуноиндикации вирусных антигенов в патологическом материале используют различные варианты реакций иммунитета 2 и 3 поколений (РПГА, РИФ, ИФА, РТПГА и др.). Известным компонентом реакций являются иммунные противовирусные сыворотки.

5. Молекулярно-генетические методы.

Эти методы широко используют как для диагностики вирусных инфекций, так и для анализа вирусных ДНК и РНК и их взаимодействий. В первую очередь МГМ применяются для выявления персистирующих вирусов, находящихся в клиническом материале, которые с трудом или вообще не обнаруживаются другими методами. Эти методы достаточно просты и позволяют быстро обнаруживать НК или ее фрагменты.

Существует две разновидности МГМов - ДНК-зондирование (ДНКгибридизация) и ПЦР.

Метод ДНК-гибридизации основан на способности денатурированной одноцепочечной ДНК достраивать гомологичную цепь в бесклеточной системе. В качестве материала для этой второй нити используют лабораторно приготовленные фрагменты молекулы ДНК, гомологичные фрагментам ДНК искомых вирусов. Их называют ДНК-зонды.

Медицинская промышленность выпускает различные типы ДНК-зондов. Для регистрации включения зонда в ДНК вируса, если она присутствует в исследуемом материале, зонд метят либо радиактивной, либо ферментной меткой. В последнем варианте при добавлении субстрата возникает окраска, видимая невооруженным глазом.

250

В основе ПЦР лежит способность молекул НК и ее фрагментов при определенных условиях нарабатывать неограниченное число копий, что позволяет существенно облегчить их выявление.

Задание.

1.Ознакомиться с демонстрацией основных методов диагностики вирусных инфекций.

2.Поставить реакцию ГА с вирусом гриппа.

3.Поставить реакцию ТГА для идентификации вируса, выделенного от больного ОРВИ.