uchebnik

231

Диагностическое значение имеет не сам факт обнаружения антител, а нарастание их титра по мере развития заболевания, что устанавливают при исследовании парных сывороток.

В микробиологической диагностике ОКИ все более широко используются методы, не связанные с выделением чистой культуры возбудителя. Они более экономичны, экспресны и вполне надежны. Эти методы основаны на индикации антигенов энтеробактерий в фекалиях или иных субстратах от больного (слюна, моча). Это методы иммунолюминесцентного анализа, РПГА с антительными эритроцитарными или латексными диагностикумами, реакция Ко-агглютинации.

Задание.

1.Провести бактериологическое исследование фекалий больного с подозрением на ОКИ.

2.Поставить РПГА с антительным шигеллезным диагностикумом с материалом от больного с подозрением на дизентерию.

3.Поставить реакцию Ко-агглютинации с реагентом на сальмонеллы группы В с материалом от больного с пищевой токсикоинфекцией.

232

Занятие 11. Тема: Микробиологическая диагностика дифтерии.

Возбудитель дифтерии - токсигенные штаммы C.diphtheriae. Поэтому лечат больных дифтерией антитоксической сывороткой, а для ее профилактики применяют дифтерийный анатоксин.

Микробиологические исследования проводят с целью диагностики дифтерийной инфекции и выявления носительства (носители токсигенных штаммов - основные источники инфекции). Важным звеном лабораторного контроля за дифтерией является определение напряженности противодифтерийного иммунитета (содержание антитоксина в крови).

Основной метод микробиологической диагностики дифтерии - бактериологическое исследование. При обычной локализации поражений материал от больного - мазки из ротоглотки и носа, а при дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище) - из очага поражения. Среды для первичного посева - кровяной теллуритовый агар, или среда Клауберга.

На этих средах, в зависимости от биовара (гравис или митис), дифтерийные бактерии дают светло-серые выпуклые, блестящие, с ровным краем или складчатые с неровным краем колонии. Их отсевают для накопления и последующей биохимической (глюкоза+, сахароза–, мочевина–, цистеин+) идентификации. Обязательным этапом идентификации является определение токсигенности. Токсигенность выявляется методом диффузионной преципитации в агаре с использованием индикаторных бумажных дисков с антитоксином или в РПГА с эритроцитарным дифтерийным антительным диагностикумом (взвесь эритроцитов, на которых сорбирован дифтерийный антитоксин).

Контроль за напряженностью противодифтерийного иммунитета (определение содержания антитоксина в крови) проводят в РПГА с использованием эритроцитарного дифтерийного диагностикума (взвесь эритроцитов, на которых сорбирован дифтерийный анатоксин).

Задание.

1.Провести бактериологическое исследование мазка из зева больного с подозрением на дифтерию.

2.Поставить РПГА по обнаружению дифтерийного антитоксина в крови обследуемого.

233

Занятие 12. Тема: Микробиологическая диагностика туберкулеза.

Возбудители туберкулеза у человека - M.tuberculosis (человеческий тип), M.bovis (бычий тип), M.avium (птичий тип), M.kansassii, M.xenopii, M.tortuitum. Другие виды микобактерий вызывают заболевания, которые следует называть микобактериозы.

Для микробиологической диагностики туберкулеза могут быть использованы различные методы:

1.бактериоскопический

2.бактериологический

3.ускоренный

4.серологический

5.аллергический

6.молекулярно-генетический

Всвязи с разнообразием клинических проявлений заболевания материал для исследования может быть разнообразным. Это - мокрота, гной, экссудат, промывные воды желудка и бронхов, ликвор, моча, пунктаты лимфоузлов и закрытых полостей, секционный материал.

люминесцентная микроскопия с использованием люминесцентных красителей. Окраска по методу Циля-Нильсена.

Метод основан на способности микобактерий сохранять окраску карболовым фуксином после обесцвечивания препарата кислотой или спиртом, что обусловлено высоким содержанием в них липидов.

Окраска люминесцентными красителями.

Метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители. В зависимости от красителя (родамин или аурамин) M.tuberculosis дают четкое ярко-красное/золотисто-желтое свечение на зеленом/темно-зеленом фоне.

2. Бактериологическое исследование.

Перед посевом исследуемый материал подвергается специальной обработке. Ее цель - полное сохранение жизнеспособности возбудителей туберкулеза и подавление неспецифической микрофлоры. Обработанный материал засевают на 2-3 пробирки со специальными средами (ЛевенштейнаЙенсена, Мордовского, Финн-2). Особенностью этих сред является наличие глицерина как фактора роста. Микобактерии растут медленно. Посевы начинают просматривать через 7-10 дней. Вирулентные культуры, как правило, дают бородавчатые морщинистые R-формы колоний различной величины. Они формируются через 21-28 дней. Из них готовят мазки, окрашивают их по ЦилюНильсену и проводят идентификацию по морфологическим, культуральным и биохимическим тестам. Наиболее существенными являются продукция

234

никотиновой кислоты, ниациновый тест, способность к редукции нитратов, пероксидазная и амидазная активность.

3. Ускоренные методы диагностики туберкулеза.

Одним из них является метод микрокультур Прайса. Мазки из мокроты обрабатывают 6% серной кислотой. При этом сопутствующая микрофлора погибает, а кислотоустойчивые микобактерии сохраняют жизнеспособность. Кислоту отмывают стерильным физиологическим раствором и мазки помещают во флаконы с жидкой питательной средой (гемолизированная кровь). Сохранившие жизнеспособность микобактерии размножаются (на стекле) и формируют микроколонии, “косы”. Через 2-3 дня вынимают по 2-3 мазка, фиксируют в жидком фиксаторе, окрашивают по Цилю-Нильсену и микроскопируют. “Косы” обнаруживаются значительно легче, чем единичные клетки кислотоустойчивых микобактерий.

4.Серологические методы имеют целью выявление сывороточных антител. Для этого могут быть использованы различные реакции иммунитета: РСК, РИФ, РПГА, ИФА. Высокой чувствительностью отличается методика, основанная на обнаружении антител к липоарабиноманнамовому комплексу микобактерий (система MycoDot).

5.Аллергический метод.

Этот метод используется: 1. для диагностики заболевания туберкулезом; 2. для выявления инфицированных лиц; 3. оценки напряженности иммунитета и отбора контингентов, подлежащих ревакцинации. Метод реализуется путем постановки диагностической аллергической пробы с туберкулином (реакция Манту).

6. Для диагностики туберкулеза предложена модификация ПЦР со специфическими праймерами.

Задание.

1.Промикроскопировать мазки из мокроты окрашенные по ЦилюНильсену.

2.Промикроскопировать препарат микроколоний по Прайсу.

3.Ознакомиться с ростом микобактерий туберкулеза на среде Финн 2.

4.Дать оценку результатам туберкулиновых проб.

235

Занятие 13. Тема: Микробиологическая диагностика заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП).

Инфекции, передаваемые половым путем (ИППП) - большая группа этиологически неоднородных заболеваний, возбудители которых относятся к различным группам микроорганизмов. Эти болезни объединяют по эпидемиологическому признаку. Основным путем их передачи является половой контакт. Все они антропонозы.

В таблице 12 приведена современная классификация ИППП, принятая

ВОЗ.

Таблица 12

Классификация заболеваний, передаваемых половым путем.

Инфекции, передаваемые половым путем, с преимущественным поражением половых органов

Инфекции, передаваемые половым путем, с преимущественным поражением других органов

236

Из данных таблицы видно, что хотя при инфекциях, передаваемых половым путем, преимущественно поражается мочеполовой тракт человека, это далеко не единственная локализация процесса!

Прежде всего выделяют традиционные “классические” венерические болезни: сифилис, гонорею, мягкий шанкр (шанкроид), венерический лимфогрануломатоз, венерическую (паховую) гранулему.

Во вторую группу включены болезни с преимущественным поражением половых органов: урогенитальный хламидиоз, мочеполовой трихомониаз, мочеполовой микоплазмоз, генитальный герпес, контагиозный моллюск гениталий и другие.

Третью группу составляют заболевания передаваемые половым путем, но с преимущественным поражением других органов. Это прежде всего ВИЧ инфекция, гепатит В, цитомегаловирусная инфекция, амебиаз, лямблиоз.

Особенностью ИППП в настоящее время является их частая ассоциация друг с другом и с заболеваниями, вызванными другими микроорганизмами, с чем связана многоочаговость поражений, тяжесть осложнений и трудность терапии.

Ниже представлены сведения об инфекциях, относящихся к первой и второй группам, то есть тех, при которых в основном поражается мочеполовая система.

Классические венерические заболевания.

1. Сифилис.

Сифилис - одна из классических венерических болезней. Возбудитель - Treponema pallidum (бледная трепонема). Она имеет форму правильной спирали размером до 15 мкм, с 8-12 крутыми глубокими равномерными завитками, концы заострены. Из многих антигенов возбудителя наиболее изучены три: липополисахаридный кардиолипин, белковый и нуклеопротеиновый. Treponema pallidum очень требовательны к питательным средам и на обычных средах не растут. Для их культивирования используют сложные среды, содержащие почечную и мозговую ткань. Посевы культивируют в строго анаэробных условиях при температуре 350С. При нагревании до 600С возбудитель быстро погибает. Под действием пенициллина переходит в L-формы.

Для сифилиса характерно волнообразное течение. Выделяют первичный, вторичный и третичный периоды болезни.

Первичный период начинается с появления на месте внедрения возбудителя (слизистая половых органов, анальное отверстие, полость рта) первичной сифиломы (твердого шанкра). Его продолжительность 45-50 дней. Он делится на: серонегативный (2-3 недели) и сменяющий его серопозитивный (в крови появляются антитела).

Вторичный период развивается при отсутствии лечения, как результат генерализации инфекции. Он может продолжаться 3-4 года.

237

Третичный период. Для него характерно образование грубых поражений кожи, слизистых оболочек, паренхиматозных органов, костей.

Методы микробиологической диагностики.

Основными методами микробиологической диагностики сифилиса являются:

•бактериоскопический;

•серологический.

Бактериоскопическое исследование.

Оно является одним из основных методов диагностики при первичном

сифилисе. Исследуют материал из первичной сифиломы, пунктат лимфатических узлов. Из него готовят мазки, окрашивают их по РомановскомуГимза и микроскопируют. Используют и темнопольную микроскопию неокрашенных мазков.

Серологическое исследование.

Оно становится возможным с 3-4 недели заболевания и является основным методом диагностики сифилиса. Антитела выявляют в осадочных тестах (на основе реакции преципитации), РСК и реакций с мечеными антиглобулиновыми сыворотками.

Всерологической диагностике сифилиса используются две группы стандартных антигенных препаратов, нетрепонемные и трепонемные. Первые (кардиолипин бычьего сердца) имеют лишь сходство с антигенами возбудителя сифилиса, вторые являются либо стандартными штаммами Treponema pallidum, либо их ультразвуковым дезинтегратом.

С кардиолипиновыми антигенами ставят осадочную микрореакцию преципитации (МР), р.Кана (флокуляционный тест) и РСК, с трепонемными - РСК и реакцию иммобилизации трепонем.

Оценка результатов реакции качественная, по системе + + + +.

Внастоящее время в серодиагностике сифилиса широко используются иммунолюминисцентные и иммуноферментные методики, для реализации которых предложен ряд коммерческих тест систем.

2. Гонорея.

Возбудителем гонореи является Neisseria gonorrhoeae - грамотрицательный диплококк, имеющий форму кофейных зерен. Спор, капсул не образуют. Высокотребовательны к питательным средам. Растут на асцит-агаре, среде Бейли или других специальных средах, лучше при содержании в атмосфере 3- 10% СО2. Крайне неустойчивы в окружающей среде. В мазках из гнойного отделяемого обычно располагаются внутриклеточно в протоплазме лейкоцитов. От других представителей рода Neisseria отличаются по культуральным, биохимическим свойствам и антигенному строению.

По длительности течения заболевания и выраженности клинических симптомов выделяют следующие формы гонореи:

238

•Свежая (с длительностью заболевания до двух месяцев), которая подразделяется на острую, подострую и торпидную;

•Хроническая (вяло текущее заболевание, продолжительностью более двух месяцев или с неустановленной давностью).

Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностике гонореи используются следующие методы:

•бактериоскопический;

•бактериологический;

•серологический;

•методы иммуноиндикации;

•молекулярно-генетические методы.

Бактериоскопическое исследование.

Материалом является отделяемое слизистой уретры и прямой кишки, сок

простаты у мужчин; отделяемое уретры, шейки матки, прямой кишки - у женщин. Мазки окрашивают по Граму или метиленовым синим и микроскопируют. При обнаружении типичных по морфологии, внутриклеточно расположенных диплококков, выдается положительный ответ.

Бактериологическое исследование.

Выделения из уретры, сок простаты, мазки из влагалища или шейки матки сразу после забора засевают на асцит-агар, среду Бейля или специальные среды для гонококков. Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по обычной схеме.

Серологическое исследование.

Материалом для исследования является сыворотка крови обследуемого, в которой в РСК (реакция Борде-Жангу), или с использованием других методик ищут антитела к гонококку.

Иммуноиндикация.

Для выявления гонококкового антигена в отделяемом больных гонореей или в осадке мочи используют РСК, методы прямой или непрямой иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа.

Молекулярно-генетическое исследование.

Для обнаружения в патологическом материале или биоптатах пораженных тканей нуклеотидных последовательностей ДНК гонококков используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с соответствующими праймерами.

3. Шанкроид (мягкий шанкр).

Возбудитель заболевания относится к роду Haemophilus, виду Haemophilus ducrey. Он представляет собой короткую тонкую грамотрицательную палочку с несколько закругленными концами и перетяжкой в середине. Располагаются одиночно или в виде цепочек. Биологической особенностью гемофилов, в том числе и Haemophilus ducrey является потребность в факторах роста,

239

присутствующих в крови. Поэтому для их культивирования применяют специальные среды, содержащие кровь. На плотных питательных средах образуются мелкие сероватые колонии, а в бульоне с 20% крови - взвешенные и оседающие на дно и стенки пробирки зерна. От других представителей рода гемофиллов Haemophilus ducrey дифференцируется по биохимическим свойствам.

Методы микробиологической диагностики.

Для микробиологической диагностики шанкроида используются следующие методы:

•микроскопический;

•бактериологический;

•методы иммуноиндикации;

•молекулярно-генетические.

Микроскопическое исследование.

Материалом для исследования является отделяемое язвы. Из него готовят

мазок, окрашивают по Романовскому-Гимза или метиленовым синим. При микроскопии в препаратах видны ряды цепочек мелких палочек, расположенных в виде “стаи рыб” между лейкоцитами.

Бактериологическое исследование.

Материалом для исследования является отделяемое язвы. Сразу после забора его засевают на специальные питательные среды. Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в них добавляют ванкомицин. Посевы инкубируют в атмосфере, содержащей 5% СО2 и учитывают через 48 часов. Идентификацию культур проводят по обычной схеме.

Иммуноиндикация.

Для выявления антигенов возбудителя используют тест системы для иммуноферментного анализа.

Молекулярно-генетические методы.

Для обнаружения в отделяемом язвы нуклеотидных последовательностей ДНК возбудителя используют полимеразную цепную реакцию.

4. Венерическая (паховая) гранулема, донованоз.

Возбудитель донованоза Calymmatobacterium granulomatis - полиморфный, грамотрицательный микроорганизм, который имеет форму палочек с закругленными концами, располагающихся одиночно или скоплениями. Имеют капсулу, неподвижны. Высокотребовательны к питательным средам. Растут на средах с яичным желтком при температуре 370С, но культивирование редко бывает успешным. Размножаются в желточном мешке развивающихся куриных эмбрионов.

Донованоз - эндемичен для Новой Гвинеи, Индии, стран Центральной и Южной Африки. В Европе это заболевание встречается редко.

240

Методы микробиологической диагностики.

Основным методом микробиологической диагностики является микроскопия. Из материала взятого из очага пораженной ткани готовят мазки. Окрашивают их по методу Романовского-Гимза и микроскопируют. Обнаруживают бактерии и внутриклеточные включения (тельца Донована). Тела бактерий окрашены в голубой, а включения в синий или черный цвет.

Инфекции, передаваемые половым путем, с преимущественным поражением половых органов.

1. Урогенитальный хламидиоз.

Возбудители урогенитального хламидиоза (УХ) это прокариоты, облигатные внутриклеточные паразиты. Они относятся к семейству Chlamydiaceae роду Chlamydia. Известно 4 вида хламидий: Chlamydia pecorum, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis. Последний является возбудителем УХ. Хламидии - облигатные внутриклеточные паразиты. Существуют в двух формах - ретикулярные тельца и элементарные тельца. На искусственных питательных средах не растут. Их культивируют в культурах ткани.

По своей антигенной структуре хламидии делятся на 15 сероваров. Серовары от D до К вызывают урогенитальный хламидиоз, серовары L1 - L3 - венерическую лимфогранулому, так называемую четвертую венерическую болезнь.

В таблице 13 представлены основные клинические проявления урогенитального хламидиоза при различной локализации возбудителя.