uchebnik

Задание:

Ознакомиться с устройством и работой отделения стерилизации, формами учета и контроля.

212

Занятие 2. ) Тема: Культивирование бактерий. Питательные среды. Методы микробиологической диагностики.

Культивирование - это выращивание бактерий в лабораторных условиях. Оно осуществляется в термостатах или специальных реакторах в диагностических целях и в биотехнологическом производстве. Термином культура обозначается совокупность бактерий. Чистая культура - совокупность бактерий одного вида.

Для культивирования бактерий используют питательные среды. К ним предъявляется ряд требований:

1.Питательность - должны содержать доступные источники азота, углерода и энергии.

2.Изотоничность - должны содержать набор солей для поддержания осмотического давления.

3.Оптимальный рН - для большинства бактерий 7,2-7,6. 4.Оптимальный rН - высокий для аэробов, низкий для анаэробов. 5.Прозрачность - чтобы был виден рост бактерий. 6.Стерильность - чтобы не было других бактерий.

По консистенции питательные среды бывают жидкие, плотные и полужидкие.

По составу питательные среды делят на:

1.Простые - 1% пептонная вода, мясопептонный бульон/агар, бульон/агар Хоттингера.

2.Сложные - сахарный бульон/агар, сывороточный бульон/агар, кровяной агар, желчный бульон, желточно-солевой агар.

3.Синтетические - среды известного состава.

По назначению питательные cреды делят на:

1.Дифференциально-диагностические - на них разные виды бактерий дают различный рост.

2.Элективные - на них одни виды растут, другие нет.

3.Среды накопления - на них одни виды размножаются быстрее других. Большинство используемых в бактериологической лаборатории

питательных сред выпускаются в виде полуфабрикатов, а некоторые - в готовых

купотреблению формах.

Влабораториях в плановом порядке ведется контроль качества питательных сред с обязательной регистрацией его результатов.

Задание:

Ознакомиться с полуфабрикатами основных питательных сред. Провести контроль качества одной питательной cреды.

Методы микробиологической диагностики.

213

В работе микробиологической лаборатории используются различные методы диагностики:

1.Бактериоскопический - обнаружение микроорганизмов в мазках из исследуемого материала и их морфологическая идентификация.

2.Бактериологический - выделение из исследуемого материала чистой культуры и ее идентификация.

2.1.Биопробный (биологический) - выделение чистой культуры путем заражения экспериментальных животных.

3.Иммунологический - использование реакций иммунитета.

3.1.Серологический - обнаружение в сыворотке обследуемого антител и нарастания их титра.

3.2.Иммуноиндикация - обнаружение в исследуемом материале микробных антигенов.

3.3.Аллергический - выявление состояния инфекционной аллергии (инфицированности).

4.Генетический - обнаружение в исследуемом материале нуклеотидных последовательностей (фрагментов ДНК) микроорганизмов.

Для реализации каждого из этих методов необходимо иметь отдельное помещение, необходимое оборудование и расходные материалы.

Задание:

1. Ознакомиться с работой подразделений лаборатории.

*) Занятие проводится на базе бактериологической лаборатории.

214

Занятие 3. Тема: Бактериологическое исследование. Методы выделения чистых культур. Принципы видовой и внутривидовой дифференцировки бактерий. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

Бактериологическое исследование - один из основных видов работы бактериологической лаборатории. Его цель - выделение из исследуемого материала чистой культуры (чистых культур) и ее (их) идентификация.

Алгоритм бактериологического исследования.

Первичная микроскопия исследуемого материала (необязательный). Первичный посев - получение изолированных колоний (чистой

культуры).

Накопление чистой культуры.

Идентификация выделенной культуры и ее углубленное изучение.

Первичная микроскопия дает ориентировочные представления о наличии в исследуемом материале микроорганизмов, а иногда позволяет провести их первичную идентификацию (гонококк, менингококк, стрептококк, пневмококк).

Первичный посев проводится для получения чистой культуры (культур).

Методы выделения чистых культур.

Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды.

Использование элективных питательных сред.

Создание условий благоприятных для развития только одного вида /рода бактерий.

После инкубации первичного посева (24-48 часов) в термостате (370С) формируются колонии бактерий. Колония - видимое невооруженным глазом на поверхности плотной питательной среды изолированное скопление бактерий одного вида, т.е. чистая культура.

Разные виды бактерий образуют разные по тем или иным признакам (форма, величина, прозрачность, характер поверхности, высота, цвет, консистенция) колонии.

Изучение колоний проводится по определенной схеме и заканчивается микроскопией окрашенного по Граму мазка (чтобы знать какие по морфологии клетки образуют колонию) и пересевом части ее на скошенный агар.

3.Пересев на скошенный агар обеспечивает накопление большого количества чистой культуры для ее последующего изучения и идентификации. Особенности роста на скошенном агаре и характеристика колоний определяют культуральные свойства бактерий.

4.В основе видовой идентификации бактерий лежит изучение особенностей их метаболизма (углеводного и белкового обмена) и антигенного строения.

215

Изучение углеводного и белкового метаболизма - биохимическая идентификация. Она проводится посевом на среды, содержащие тот или иной известный субстрат (углевод, спирт, аминокислоту, полисахарид, белок) или с помощью специальных индикаторных систем.

Изучение антигенного строения - серологическая идентификация - проводится в реакции агглютинации по идентификации с помощью соответствующих агглютинирующих сывороток, выбор которых определяется результатами биохимической идентификации.

У выделенной и идентифицированной до вида чистой культуры могут быть изучены различные интересующие врача признаки (наличие факторов вирулентности, токсигенность, плазмидный профиль, факторы персистенции и др.), а также проведена ее внутривидовая дифференцировка. Она включает определение принадлежности штамма к тому или иному фаговару, серовару, колициновару, ферментовару. Внутривидовая дифференцировка позволяет выявлять эпидемиологические связи между штаммами бактерий одного вида. Одним из важных биологических свойств, которые изучают у культур, выделенных от больных, является антибиограмма - чувствительность к антибиотикам. Эти сведения необходимы не только для выбора режима рациональной химиотерапии, но могут служить и дополнительным эпидемиологическим маркером.

Определение чувствительности к антибиотикам проводится качественным (бумажных дисков) или количественным (серийных разведений) методами.

Результаты бактериологического исследования документируются в протоколе, который является отчетным документом.

Задание:

Провести бактериологическое исследование смеси бактерий. Оформить протокол бактериологического исследования.

Ознакомиться с методами внутривидовой дифференцировки (фаготипирование стафилококков).

Определить чувствительность бактерий к антибиотикам методом дисков.

216

Приложение 1

Схема описания колоний.

Изучение особенностей роста на чашках с мясо-пептонным агаром включает:

1.Общую характеристику роста – однородный или неоднородный, обильный или скудный рост и его количественную оценку (если ставится такая задача).

2.Изучение выросших колоний – для этого отбирают отдельные изолированные колонии, обводят их со стороны дна чашки карандашом по стеклу, проставляют порядковый номер и просматривают, определяя:

Макроскопически:

В проходящем свете – форму (правильная или неправильная), величину (точечная - до 1 мм, мелкая - 1-2 мм, средняя - 2-4 мм, крупная - 4-6 мм),

прозрачность (прозрачная, полупрозрачная или непрозрачная),

В отраженном свете – высоту (плоская, плоско-выпуклая или выпуклая), поверхность (гладкая, блестящая или матовая, шероховатая), цвет (цвета среды - неокрашенная или

пигментированная - окрашенная в тот или иной цвет).

Микроскопически:

При малом увеличении (сухой объектив) – края (ровные или неровные),

структуру (гомогенная - однородная, негомогенная - неоднородная, зернистая, гирозная).

Из колонии готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют. Описывают морфологию бактерий, образующих колонию. Во время взятия материала из колонии для мазка отмечают консистенцию колонии (мягкая, крошащаяся, слизистая или твердая).

Изучение колоний заканчивается пересевом на скошенный агар для накопления чистой культуры.

217

Приложение 2

Протокол бактериологического исследования

(материал для исследования)

клинический диагноз

цель исследования

218

Занятие 4. Тема: Санитарная микробиология.

Санитарная микробиология изучает микробиологию среды обитания, производственной деятельности человека, пищевых продуктов. В медицинских учреждениях круг изучаемых ее объектов включает, кроме того, медицинские инструменты, предметы ухода за больными и лекарственные препараты.

Проведение санитарно-микробиологических исследований в лечебнопрофилактических учреждениях регламентировано соответствующими инструктивными документами. Их выполнение и результаты подлежат строгому учету и контролю.

Объекты санитарно-микробиологических исследований в ЛПУ:

Воздух. Определяется ОМЧ (общее микробное число) воздуха тех или иных помещений и наличие в нем санитарно-показательных микроорганизмов ( гемолитические стафилококки, стрептококки). Допустимые уровни микробной загрязненности воздуха в ЛПУ регламентируются приказами МЗ РФ №215 и №345.

Методы санитарно-микробиологического исследования воздуха - седиментационный (осаждения) и аспирационный (посев определенного объема воздуха).

2.Инструменты, предметы ухода за больными , больничный инвентарь. С инструментов, предметов ухода за больными, инвентаря (жесткого и мягкого) делаются смывы, которые засеваются на элективные среды (для стафилококков, сальмонелл, псевдомонад) с последующим выделением и идентификацией возбудителей. Степень обсемененности определяется количественным посевом (с определенной площади, известный объем).

3.Лекарственные растворы. Исследуют как и другие объекты медицинского назначения путем прямого посева на те или иные среды.

Задание:

Ознакомиться с инструктивными документами, регламентирующими проведение санитарно-микробиологических исследований в ЛПУ.

Провести санитарно-микробиологическое исследование воздуха лаборатории.

Провести санитарно-микробиологическое исследование медицинского инструментария и предметов ухода за больными.

219

Занятие 5. Тема: Нормальная микрофлора тела человека. Дисбактериоз, его диагностика и методы коррекции.

Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. Наиболее полно изучена нормальная микрофлора толстого кишечника, кожи, влагалища, полости рта.

О существенном ее значении в поддержании жизнедеятельности организма свидетельствуют наблюдения за животными гнотобионтами.

Основные функции нормальной микрофлоры.

Антагонистическая (обеспечивает колонизационную резистентность). Иммуногенная (обеспечивает постоянный тренинг иммунной системы). Пищеварительная (участвует в полостном пищеварении). Витаминообразующая.

Метаболическая (участвует в обмене уратов, оксалатов, стероидов, холестерина, липидов).

Нормальная микрофлора отдельных биотопов различна, но подчиняется ряду основных закономерностей:

Она представлена несколькими видами, среди которых выделяют доминантные и виды наполнители.

Преобладающими являются анаэробные бактерии. Она образует биопленку.

Нормальная микрофлора достаточно стабильна.

Качественные и количественные нарушения состава нормальной микрофлоры - дисбиоз (дисбактериоз).

Причины развития дисбиоза различны. Основные из них: Нерациональная антибиотикотерапия.

Гормонотерапия.

Тяжелые инфекционные и соматические заболевания. Интоксикации, в том числе производственные. Радиационные поражения.

Клинические проявления дисбиоза многочисленны и разнообразны, но он может протекать и без выраженных клинических проявлений.

Диагностика дисбактериоза основана на количественном бактериологическом исследовании материала, взятого из того или иного биотопа. Наличие дисбиоза определяется изменениями состава нормальной микрофлоры, а его выраженность степенью этих изменений.

Показатели дисбактериоза.

Снижение общего числа бактерий, представителей нормальной микрофлоры или их отдельных представителей.

Увеличение числа редко встречающихся или появление не свойственных данному биотому видов.

Появление измененных вариантов представителей нормальной микрофлоры.

220

Для диагностики дисбактериоза кишечника могут быть использованы методы обнаружения необычных продуктов метаболизма (хроматография спектра жирных кислот).

Коррекция дисбактериоза.

Выявление и устранение причин его развития.

Восстановление состава нормальной микрофлоры. С этой целью используют пробиотики (эубиотики).

Задание

Изучить состав нормальной микрофлоры кожи рук.

Ознакомиться с результатами исследования микрофлоры фекалий на дисбактериоз и оценить его результаты.

Приложение Таблица 11

Содержание нормальной микрофлоры в 1 гр. фекалий.