Определение полосы флюоресценции рибофлавина.

Рибофлавин — флюоресцирующий водорастворимый витамин группы В. Очень часто флюоресцирующие витамины определяют методом жидкостной хроматографии с флюоресцентным детектором. Для настройки детектора необходимо знать длину волны возбуждения, при которой флюоресценция будет максимальной — тогда и чувствительность определения будет максимальной.

Приготовьте раствор рибофлавина с концентрацией 100мг/л. Для этого поместите на аналитические весы бюкс или маленький стаканчик, уравновесьте тару и поместите в стаканчик 90-110 мг рибофлавина. Запишите вес с точностью до четвертого знака после запятой. Количественно перенесите навеску в мерную колбу на 1000 мл (делайте это с преподавателем) и прилейте в колбу 600-800 мл бидистиллированной воды. Поместите колбу в ультразвуковую баню на 30 минут и доведите раствор до метки бидистиллированной водой. Перемешайте раствор многократным переворачиванием мерной колбы.

Налейте в кювету полученный раствор и зарегистрируйте спектр флюоресценции при полосе возбуждения 220 нм. Если интенсивность полосы флюоресценции очень велика, количественно (с помощью мерной посуды — дозаторов и мерных колб) разбавьте раствор так, чтобы интенсивность флюоресценции была в пределах 150-200 единиц. Степень разбавления запишите.

После сканирования и запоминания спектра измерьте координаты полосы флюоресценции, поставьте полосу возбуждения 240 нм и снова сканируйте спектр флюоресценции. Измерьте координаты полосы флюоресценции и сравните их с предыдущим спектром. Ваша задача — определить длину волны возбуждения, при которой интенсивность полосы флюоресценции будет максимальной. Для этого вам необходимо увеличивать длину волны возбуждающего света и вновь сканировать спектр флюоресценции.

После того, как вы определите нужную длину волны возбуждения, приготовьте, используя имеющиеся растворы, серию градуировочных растворов рибофлавина и определите градуировочную функцию.

Рассчитайте по градуировочной функции предел обнаружения рибофлавина методом флюоресцентной спектрофотометрии. Пределом обнаружения считают концентрацию, аналитический сигнал от которой будет в два три раза больше шумов.

Определить величину шумов просто — выделите мышью область спектра без полос флюоресценции и увеличьте её. Ровная линия спектра превратилась в изломаную. Это и есть шумы. Измерьте ординату их нижнего уровня, а потом ординату верхнего уровня. Интервал между этими ординатами и будет удвоенными шумами (Шумы откланяются от измеряемого сигнала и в положительную и в отрицательную стороны — ± — и потому интервал между ординатами нужно разделить на два).

Умножьте полученную величину на три — таков должен быть аналитический сигнал от минимальной концентрации рибофлавина, которую ещё можно определить методом флюоресцентной спектрофотометрии.

По градуировочной функции определите эту концентрацию.

А теперь приготовьте раствор рибофлавина этой концентрации и сканируйте его спектр флюоресценции.

Сравните полученный результат с расчетным и объясните расхождение.