Флюоресцентная спектрофотометрия

На лекциях мы говорили, что некоторые вещества при облучении светом начинают светиться сами. Это явление называется люминисценцией. Если свечение прекращается сразу после окончания облучения, то его называют флюоресценцией. Если свечение некоторое время ещё продолжается, то это фосфоресценция. Флюоресцентная спектрофотометрия — более чувствительный метод анализа, чем спектрофотометрия пропускания или отражения, но флюоресцируют не все вещества. Однако некоторые высокотоксичные вещества — полиароматические углеводороды, среди которых наиболее опасен канцерогенный бензпирен, микотоксины — флюоресцируют, и их можно определять этим методом. Флюоресцируют не только токсичные вещества — некоторые водорастворимые и жирорастворимые витамины и другие вещества тоже можно определять методом флюоресцентной спектрофотометрии. Очень часто флюоресцентный детектор (очень маленький флюоресцентной спектрофотометр) используют в жидкостной хроматографии.

В лаборатории кафедры товароведения и товарной экспертизы для анализа и экспертизы товаров используют высокочувствительный, снабженный двумя монохроматорами флюоресцентный спектрофотометр RF5301PC фирмы Шимадзу.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Флюоресцентная спектрофотометрия — очень чувствительный метод. ВАШИ РУКИ ДОЛЖНЫ БЫТЬ ЧИСТЫМИ, НА НИХ НЕ ДОЛЖНО БЫТЬ НИКАКОЙ КОСМЕТИКИ (КРЕМОВ И Т. Д.)! Иначе вы испачкаете кювету и результаты будут неправильными.

Ознакомление с флюоресцентным спектрофотометром rf5301pc

Включите прибор. Выключатель находится около кабеля питания (справа, если вы стоите лицом к прибору).

Найдите на рабочем столе компьютера ярлык

И двойным кликом откройте программу управления прибором

Откроется окно программы.

На окне программы появится идентификатор:

Нажмите ОК и идентификатор исчезнет

Вверху окна найдите панель

И нажмите кнопку

Появится спадающее меню:

В верхней части этого меню указаны те режимы работы прибора, которые вы можете выбрать. Спектрометр может регистрировать спектры флюоресценции (испускания, эмиссии) или спектры возбуждения.

Спектр флюоресценции — это спектр излучения исследуемой вами пробы в указанном вами диапазоне, например от 250 нм до 900 нм, — то излучение, которое испускает проба при облучении светом с выбранной вами длиной волны — например, 230 нм. В этом случае 230 нм — это длина волны излучения «возбуждения».

Спектр возбуждения (excitation) — это зависимость интенсивности излучаемого вашей пробой излучения при выбранной вами длине волны, например 500 нм, от длины волны падающего на вещество излучения — например от 220 нм до 700 нм.

Наиболее часто в количественном анализе используют спектры флюоресценции (эмиссии). Это строка 2D Emission Measurement

Прибор позволяет регистрировать и «трехмерные» спектры — вы задаете начальную длину волны возбуждения и интервал (increment) — «шаг» прибора. Зарегистрировав спектр флюоресценции при этой длине волны, прибор перейдет к следующей длине волны с указанным шагом и снова зарегистрирует спектр флюоресценции. И так до конца указанного вами диапазона.

Трехмерные спектры — это очень долго и дорого, потому что срок службы ксеноновой лампы всего 500 часов.

Вам нужно будет зарегистрировать 2D Emission Measurement.

Выберите этот пункт.

На экране появится окно инициализации прибора — прибор начинает тестировать работоспособность своих устройств:

Дождитесь, пока прибор на закончит инициализацию и это окно не примет следующий вид:

Если не все устройства успешно прошли тест (красный сигнал), позовите преподавателя. Если всё благополучно (везде зеленый сигнал), продолжайте работу.

Закройте окно инициализации и основное окно управления программой примет следующий вид:

В правой части окна вы можете выставить нужные режимы регистрации спектра и, если необходимо, изменить выбранные ранее режим регистрации (например, перейти от регистрации спектра флюоресценции к регистрации спектра возбуждения):

Смена режима возможно при нажатии справа стрелки-указателя в строке «2D Emission Measurement». Спадающее меню при нажатии этой стрелки таково:

Мы не будем менять выбранный режим и установим длину волны возбуждения 220 нм, а для диапазона спектра флюоресценции установим старт 230 нм, конец 900 нм.

Прежде, чем начать измерение, обратите внимание на кювету, в которую вы будете наливать исследуемый раствор. Все четыре её грани — рабочие, потому что флюоресценцию прибор измеряет перпендикулярно к направлению облучения возбуждающим светом. И трогать их нельзя! Флюоресценция — очень чувствительный метод, и если вы испачкаете стенки кюветы, результаты анализа будут ошибочными.

ВАШИ РУКИ ДОЛЖНЫ БЫТЬ ЧИСТЫМИ, НА НИХ НЕ ДОЛЖНО БЫТЬ НИКАКОЙ КОСМЕТИКИ И БРАТЬ КЮВЕТУ ДАЖЕ ЧИСТЫМИ РУКАИМИ МОЖНО ТОЛЬКО ЗА ВЕРХЮЮ ЧАСТЬ РЕБЕР!!!

Налейте в кювету бидистиллированной воды, откройте кюветное отделение прибора и поместите кювету в держатель.

Сверху этого окна находятся кнопки начала регистрирования спектра, отмены регистрации, перехода к режиму просмотра и индикатор открытия источника (Shutter):

Нажмите на кнопку «Измерение» (Measure).

Прибор начинает регистрацию спектра.

Внимательно посмотрите надписи внизу рабочего окна программы.

Они сообщают вам о выбранном режиме работы, координатах курсора, состоянии индикатора заслонки источника (Открыта или закрыта. В рабочем положении открыта), работе ксеноновой лампы и текущих координатах спектра — длине волны и энергии излучения.

Панель запуска регистрации спектра во время работы выглядит так:

После окончания регистрации спектра на окне появляется приглашение запомнить спектр:

Вы можете просто нажать ОК и программа сохранит спектр под своим порядковым номером, но это неудобно, вы можете задать любое (разумное) имя спектра, можете отменить сохранение спектра, нажав Cancel.

Измерить интенсивность полосы флюоресценции можно, наведя на неё курсор. Первое число — длина волны в нм, вторая — интенсивность излучения.

Вы должны помнить, что в отличие от спектрофотометрии пропускания, интенсивность флюоресценции связана с содержанием флюоресцирующего вещества линейно!

Однако сначала разберёмся со спектром флюоресценции воды.

ВОДА НЕ ФЛЮОРЕСЦИРУЕТ!

Что же тогда регистрирует спектрофотометр?

Во-первых, как бы ни была прозрачна вода, рассеивать падающее излучение она будет. И потому в спектре будет полоса падающего излучения. Мы начали с 220 нм. Поглядите на спектр. Слева интенсивная полоса — это полоса рассеянного излучения. Вторая сильная полоса — 440 нм. Это побочный результат работы монохроматора излучения, того устройства, которое формирует излучаемый свет. Монохроматор построен из отражающих дифракционных решеток, и они посылают на образец излучение с выбранной вами длиной волны и излучение так называемого «второго порядка» дифракционной решетки — кратное ему по длине волны излучение. У решеток есть и «третий порядок», но интенсивность его будет очень мала и мы его не заметим.

Кроме лишнего излучения источника в спектре воды есть ещё и излучение комбинационного рассеяния воды. Это излучение, обусловленное фотонами, которые «ударились» о молекулы воды и отдали им часть своей энергии. Потому их энергия упадет и, следовательно, длина волны увеличится. Ниже приведена таблица длин волн пиков комбинационного рассеяния для различных растворителей.

	Растворитель
Длина волны возбуждения	вода	этанол	циклогексан	Четыреххлористый углерод	хлороформ
248	271	267	267
313	350	344	344	320	346
365	416	409	408	375	410
405	469	459	458	418	461
436	511	500	499	450	502

То есть полоса комбинационного рассеяния расположена возле полосы возбуждения.

В нашем случае это 240 нм. Так как полосы комбинационного рассеяния будут наблюдаться и для других растворителей, это необходимо учитывать при интерпретации спектров флюоресценции.

Координаты пиков — длину волны и интенсивность излучения (высота пика) измеряют, помещая курсор в выбранную точку. Нажав левую кнопку мыши, можно выделить и увеличить интересующую вас область. Это может быть удобно при измерении координат. Двойной клик на свободном месте окна возвращает прежний масштаб. Теперь вы умеете управлять прибором и мы переходим к задачам.