4. Визначення ліполітичної активності насіння

Матеріали і обладнання: 1) центрифуга на 15 тис. обертів; 2) пластмасові центрифужні пробірки з кришками на 10 мл: 3) термостат: 4) аналітичні терези; 5) бюретка для титрування на 10 мл: 6) колби на 50 мл; 7) пробірки: 8) ступки або випарювальні чашки; 9) цитрат-фосфатний буфер з рН 4,6 (51,8 мл 2,87% розчини Nа₂НР0₄ і 48,2 мл 2,1% розчини лимонної кислоти (для льону олійного); 10) цитрат-фосфатний буфер з рН 4,8 (50,7 мл 2,87% розчини Nа₂НР0₄ і 49,3 мл 2,1% розчини лимонної кислоти (для рицини); 11) 0.5 % розчин фенолфталеїну на 60% С₂Н₅0Н; 12) 0,2% розчин NаОН; 13) насичений розчин NaCl, який містить 0,05% тритон Х-100.

Для культур, які накопичують жири як запасний матеріал (льон, соняшник, рицина) дуже важливим показником є ліполітична активність насіння. Від цього показника залежить життя цих рослин на початкових етапах розвитку, коли рослина ще живиться гетеротрофно, за рахунок поживних речовин насіння.

Важливим моментом у визначенні ліполітичної активності є виділення ліпази у відносно чистому вигляді. Для цього її активують, створивши середовище з відповідною кислотністю. Для різних видів і навіть сортів вона різна, але знаходиться в діапазоні 4,2 - 5,2 рН. Активна ліпаза переходить безпосередньо в шар жиру, де починає розщеплювати його. Методом центрифугування відділяють шар жиру від водного. З шару жиру осаджують активну ліпазу насиченим розчином NаС1. Активність ліпази визначають відтитровуванням висвободжених жирних кислот 0,2% розчином NаОН.

Хід аналізу

1. Екстракція кислої ліпази насіння

Наважку (5 г) подрібненого насіння розтирають з невеликою кількістю цитрат-фосфатного буферу до гомогенного кашоподібного стану. Потім цю суміш поміщають в центрифужні пробірки і центрифугуют при 15 тис. об/хв. 15 хвилин.

Після центрифугування суміш розділяється на три шари: верхній - жировий, який містить слиз, жир та ліпазу; середній - водний, який містить водорозчинні речовини; нижній - осад.

Для виділення кислої ліпази беруть верхній жировий шар, додають до нього насичений розчин NaCl, який містить 0,05% тритон Х-100, щоб розділити слиз, жир та ліпазу (1:1 за об'ємом), збовтують суміш і центрифугують 15 хв. при 13 тис. об/хв. Утворюються 4 шари: верхній, який містить слиз; жировий шар, який містить олію; водний і осад (ліпаза). Для аналізу потрібен тільки жировий шар і осад ліпази, який розчиняють в 0,5мл буферу.

2. Визначення ліполітичної активності

В дві пробірки поміщають по 0,5 мл цитрат-фосфатного буфера, по 0,5 мл розчину ліпази і по 3 краплі олії, яка була взята з жирового шару. Одну з цих пробірок поміщають на інкубацію в заздалегідь нагрітий до 37°С термостат на 1 годину (дослід). До іншої пробірки (контроль) додають 2 краплі 0,5% розчину фенолфталеїну (розчин при цьому каламутніє) і титрують 0,2% розчином NаОН до появи стійкого блідо-рожевого забарвлення.

Після інкубації титрується і дослідна проба. За різницею між витраченим на титрування досліду і контролю NаОН розраховується ліполітична активність (мл\год).

Завдання: визначити ліполітичну активність даного насіння.

Контрольні питання

1. Як провести визначення ізоелектричної точки рослинних тканин?

2. Як провести визначення кислотного гідролізу крохмалю?

3. Як провести визначення ферментативного гідролізу крохмалю?

4. Як провести виділення ліпази насіння та визначити її активність?

3. РОСЛИННА КЛІТИНА ЯК ОСМОТИЧНА СИСТЕМА

Мета.

Дослідити основні властивості рослинної клітини як осмотичної системи, умови поглинання води клітиною в залежності від фізіологічного стану рослини, оволодіти основними засобами визначення осмотичного тиску та всисної сили клітини.

Питання до обговорення.

1. Водний потенціал. Хімічний потенціал.

2. Осмотичний тиск, тургор ний тиск.

3. Всисна сила клітини.

Вода рослинними клітинами поглинається за законами осмосу. Переміщення молекул води із зовнішнього середовища в клітину, а також від клітини до клітини відбувається за градієнтом рівня вільної енергії молекул води, який визначається їх хімічним потенціалом (μ_w). Точкою відліку рівня вільної енергії молекул води береться її рівень у молекул чистої води в стандартних умовах (μ⁰_w). Хімічний потенціал води у водних розчинах і клітинах менше ніж у чистої води. Ця різниця, звана водним потенціалом (ψ), відображає здатність води в даній системі здійснювати роботу порівняно з роботою, яку за тих же умов здійснювала б чиста вода. Водний потенціал розраховується за рівнянням

(3.1)

де — парціальний мольний об'єм води.

Водний потенціал визначає здатність молекул води дифундувати, випаровуватися або поглинатися. Він має розмірність енергії, поділеної на об'єм, що співпадає з розмірністю тиску (атмосфери, бари, паскалі).

Молекули розчинених у воді речовин знижують рівень вільної енергії молекул води. Це зниження вимірюється осмотичним потенціалом (ψ_осм).

Осмотичний потенціал — компонент водного потенціалу розчину, який визначається присутністю розчинених речовин, що знижують хімічний потенціал води. Тому (ψ_осм) завжди величина негативна. Якщо два розчини з різними концентраціями розділити напівпроникною мембраною, проникною тільки для молекул води, то молекули води переміщатимуться за градієнтом ψ — з розчину з меншою концентрацією, в якому (ψ_осм) вище (тобто менш негативна величина), в розчин з більшою концентрацією, в якому (ψ_осм) нижче (тобто більш негативна величина).

У молекул води, що знаходяться під тиском, рівень вільної енергії підвищується. Тому величина водного потенціалу розчину або клітини збільшується при підвищенні в них гідростатичного (тургорного) тиску. Водний потенціал, залежний від гідростатичного тиску (величина завжди позитивна), називається потенціалом тиску (ψ_тиску) Загальний водний потенціал клітини залежить від осмотичного потенціалу (ψ_осм) і потенціалу тиску (ψ_тиску).

(3.2)

При розміщенні клітини в чистій воді остання входитиме в клітину до тих пір, поки ψ_осм в клітині не буде урівноважений ψ_тиску, який збільшується.. Збільшення ψ_тиску відбувається через опір клітинної стінки збільшенню об'єму протопласта під час надходження до нього води.

Якщо клітину помістити у водний розчин, ψ_осм якого буде більш негативним, ніж, ψ_кл, то вода виходитиме з клітини в цей зовнішній розчин. При цьому ψ_кл зменшуватиметься через зменшення в клітині як ψ_осм, так і ψ_тиску. Вихід води з клітини відбуватиметься доти, поки ψ клітини і зовнішнього розчину не зрівняються.