1.3.2 Визначення швидкості руху цитоплазми

На одному з препаратів, що використовуються в роботі 1.3.1, визначають швидкість руху цитоплазми.: у елодеї і валіснерії — за переміщенням хлоропластів, у нітели і хари — за рухом окремих частинок, переміщення яких легко спостерігати разом із струмом цитоплазми. Визначення ведеться до і після дії підвищеної температури, світла, розчину етанолу, розчину натрієвої солі АТФ. Виявити вплив світла або температури можна, витримуючи препарат на яскравому світлу або в термостаті при температурі 35 і 40°С протягом 5, 10 і 15 хв.

Хід роботи

Для визначення швидкості руху цитоплазми використовують секундомір і окуляр-мікрометр мікроскопа. За допомогою секундоміра відлічують час, протягом якого хлоропласт або інша частинка, що рухається, проходить відстань між двома вибраними поділками окуляра-мікрометра. Такі вимірювання в одній і тій же клітині проводять кілька разів. За ними розраховують середню величину і середню швидкість руху, яка виражається числом поділок окуляр-мікрометра, пройдених частинкою за 1с. Якщо відома ціна поділок окуляра-мікрометра при даному збільшенні мікроскопа, то швидкість руху можна знайти, поділивши величину відстані в мікрометрах на число секунд, за які частинка проходить цю відстань (мкм/с).

Вимірювання проводять в одних і тих же клітинах до і після дії на них зовнішніх чинників, які можуть спочатку прискорювати рух цитоплазми, потім він сповільнюється і навіть зупиняється. Найнадійнішим способом стимуляції руху цитоплазми є освітлення клітин. При цьому необхідно стежити, щоб освітлення не призводило до перегріву клітин. Витримка препарату в термостаті при температурі вище 40°С, як правило, веде до припинення руху цитоплазми.

Завдання: визначити швидкість руху цитоплазми у вибраному об'єкті до і після дії на нього підвищеної температури, світла, АТФ (або іншого чинника).

Контрольні питання.

1. Як провести визначення плазмолізу і деплазмолізу в рослинній клітині

2. Проаналізуйте той факт, що хлоропласти та мітохондрії крім зовнішньої, мають ще й внутрішню мембрану. Яка функція цих внутрішніх мембран?

3. Як визначити проникність живої та мертвої протоплазми для різних речовин?

4. Як провести визначення життєздатності насіння за забарвленням цитоплазми та наявністю плазмолізу?

5. Як довести експериментально залежність швидкості руху цитоплазми від зовнішніх факторів?

2. ФІЗІОЛОГІЧНА РОЛЬ ОСНОВНИХ РОСЛИННИХ МЕТАБОЛІТІВ

Мета.

Дослідити найбільш важливі фізичні та хімічні властивості основних метаболітів рослинної клітини, зокрема білків, вуглеводів та жирів за схемою: склад – будова - функції, оволодіти основними засобами визначення фракційного складу та функціональної активності речовин в залежності від фізіологічної потреби рослинної клітини.

Питання до обговорення.

1. Функціональні групи рослинних білків. Їх склад та властивості. Ізоелектрична точка.

2. Функціональні групи рослинних вуглеводів. Будова, утворення та мобілізація.

3. Рослинні ліпіди. Жири. Склад. Утилізація.

1. Визначення ізоелектричної точки рослинних тканин

Білки складають структурну основу цитоплазми. Найважливіші каталізатори живої клітини – ферменти – також є по своїй природі білковими речовинами. Білки здатні змінювати свої властивості під впливом різних чинників (рН, температура та ін.), що позначається на структурному і фізіологічному стані цитоплазми в цілому. Одна з причин цієї мінливості полягає в тому, що білкова молекула містить в собі як позитивні, так і негативні іони, а також іони, що несуть одночасно позитивні і негативні заряди.

Білки складаються з амінокислот, сполучених між собою пептидними зв'язками. Кожна амінокислота має, принаймні, одну кислу і одну основну дисоціюючу групи, а саме карбоксильну і аміногрупу, тому амінокислоти є амфолітами і утворюють цвітеріони:

Разом з тим характер дисоціації непостійний і залежить від рН середовища. В кислих розчинах дисоціація йде по слаболужному типу, у зв'язку з чим амінокислоти виконують роль слабих основ, при дисоціації дають катіони. У присутності лугів амінокислоти при дисоціації утворюють аніони і поводяться як слабі кислоти.

В певній зоні рН дисоціація кислих і основних груп зрівнюється. Зона рН, в якій молекула білка стає електронейтральною, називається ізоелектричною точкою (ІЕТ). ІЕТ залежить від кількості вільних карбоксильних і аміногруп.

Завдяки наявності пептидного зв'язку в білках відсутні всі здатні до дисоціації вільні α-карбоксильні і α-аміногрупи, за винятком однієї кінцевої α-карбоксильної і α -аміногрупи. Проте в численних бічних ланцюгах білкової молекули є кислі і основні групи, що і обумовлює амфолітні властивості білків. Значення ІЕТ білка залежить не стільки від констант дисоціації, скільки від числа бічних ланцюгів з кислими і основними групами. Тому значення ІЕТ білків коливається в широких межах (глобулін зерна ячменю – 4,9, уреази кінських бобів – 7,2, пепсин – 1,0). Визначення ІЕТ протоплазми, безумовно, може дати відомості лише про деяку середню величину.

В ІЕТ молекула білка має мінімум електричних зарядів, а оскільки, ймовірно, зарядом визначається ступінь електростатичного притяжіння молекул води (гідратація, набухання), ІЕТ співпадає з мінімумом набухання і мінімумом розчинності білка.

Коли амфоліт дисоціює як основа, він зв'язує аніони. Це спостерігається при рН нижче його ІЕТ. В середовищі з рН вище ІЕТ амфоліт дисоціює як кислота і зв'язує катіони.

Визначення ІЕТ: при зануренні зрізів рослинних тканин в розчини з рН нижче за її ІЕТ, тканина утримує кислий барвник – еозин, у якого забарвлений аніон. В розчинах з рН вище за ІЕТ тканина утримує основний барвник – метиленовий синій, у якого забарвлений катіон. При визначенні ІЕТ окремого амфоліту спостерігається різкий перехід забарвлення від рожевого до синього. Для різних тканин перехід забарвлення від червоного до синього, знаходитиметься при різних значеннях рН.

Матеріали і обладнання: 1) 10-денні проростки квасолі, рицини; 2) препарувальне обладнання; 3) предметні і покривні скельця; 4) мікроскоп; 5) 70% етиловий спирт; 6) 0,1М розчин лимонної кислоти; 7) 0,2М розчин Na₂HPO₄; 8) 0,1% розчин еозину; 9) 0,01% розчин метиленового синього; 10) бюкси.

Хід роботи

Приготувати буферні розчини з наступними значеннями рН: 2,2; 3,0; 3,6; 5,0; 5,4; 6,0; 7,0; 8,0, використовуючи табл. 2.1

Таблиця 2.1

№	рН	0,2М розчин Na2HPO4 (в мл)	0,1М розчин лимонної кислоти (в мл)
1	2,2	0,20	9,80
2	3,0	2,05	7,95
3	3,6	3,22	6,78
4	5,0	5,15	4,85
5	5,4	5,57	4,43
6	6,0	6,31	3,69
7	7,0	8,23	1,77
8	8,0	9,72	0,28

Взяти чотири фарфорові чашки або бюкси. В першу налити 3 – 5 мл 70% розчину етилового спирту, в другу – 3 мл 0,1% розчину еозину, в третю – 3 мл 0,01% розчину метиленового синього, в четверту – 5 мл дистильованої води.

Зробити 20-25 тонких зрізів досліджуваних об'єктів. Вибрати 16 найвдаліших. Занурити їх спочатку на 5 хвилин в першу фарфорову чашку, потім по черзі на 10 хвилин в інші. Потім занурити по 2 зрізи в буферні розчини з різними значеннями рН на 1,5 – 2 години.

Таблиця 2.2

Об‘єкт	Тканина	Забарвлення тканини при різних рН								Величина ІЕТ
		2,2	3,0	3,6	5,0	5,4	6,0	7,0	8,0
	Ксилема
	Кора

Після закінчення вказаного терміну вийняти зрізи з буферних розчинів і помістити їх на предметне скло в певній послідовності. Накрити покривними скельцями і розглянути під мікроскопом. Окремі ділянки зрізу забарвляться по-різному. При рН нижче ІЕТ тканина забарвиться в рожевий колір, при рН вище ІЕТ – в синій. Якщо величина рН буферного розчину відповідає ІЕТ, тканина набуває бузкового або фіолетового забарвлення, оскільки адсорбуються в рівному ступені метиленовий синій і еозин. Якщо перехідне забарвлення не спостерігається, то ІЕТ обчислюють як середню з двох сусідніх показників. У тому випадку, коли цитоплазма кліток має суміш різних амфолітів, перехід забарвлення з одного в інше відбуватиметься в широкому діапазоні.

Завдання: заповнити таблицю 2.2 і визначити величину ІЕТ різних тканин досліджуваного об'єкту.