Лабораторная работа № 8. Оценка цитокинпродуцирующей активности клеток и концентрация цитокинов в биологических средах
Цель работы: закрепление теоретического материала по изучаемой теме, закрепление навыков культуральной работы с иммунокомпетентными клетками.
Оборудование, приборы, принадлежности: схемы продукции цитокинов, таблицы биологических свойств цитокинов
Сведения из теории
В настоящее время определение присутствия цитокинов и их концентрации, как и цитокинпродуцирующих клеток в качестве иммунодиагностических параметров находит все большее применение вследствие увеличения численности лиц с иммунозаивисмыми и иммунообусловленными заболеваниями, терапия которых включает применение рекомбинантных цитокинов. Без предварительной оценки собственных возможностей организма в биосинтезе этих веществ такая терапия может оказаться либо неуспешной, либо стать причиной развития иммунопатологических реакций. Для детекции цитокинов используют два подхода: 1) определение концентрации цитокина в сыворотке крови или другом биологическом материале, т.е. определение уровня цитокина, образовавшегося в условиях in vivo, 2) стимуляция клеток обследуемого лица in vitro (в рамках культурального метода) индуктором или антигеном для оценки цитокинсинтезирующей способности клеток. У обоих подходов есть как положительные особенности, так и ряд ограничений ( таблица 8.1).
Таблица 8.1
Особенности индукции биосинтеза цитокинов в условиях in vitro и in vivo в зависимости от задач исследования
Параметры сравнения |
Условия индукции биосинтеза цитокинов
|
|
in vivo |
in vitro |
|
1 |
2 |
3 |
Предмет исследования |
определение концентрации цитокина в сыворотке крови или другом биологическом материале |
стимуляция клеток обследуемого лица in vitro индуктором или антигеном для оценки цитокинсинтезирующей способности клеток |
Соответствие результатов исследования особенностям патологического или физиологического процесса |
Высокое, так как синтез цитокинов формируется в естественных условиях организма |
А) Вариабельное, в периферической крови в момент взятия образца для исследования могут отсутствовать лимфоциты или иные ИКК, определяющие развитие и иммунопатогенез заболевания пациента. Т.е. существует проблема несоответствия исследуемого материала диагностической цели. Б) Индукторы синтеза цитокинов в условиях in vitro не соответствуют условиям in vivo, что снижает диагностическое значение исследования |
1 |
2 |
3 |
Ограничения |
Большинство цитокинов продуцируются in loco и не выходят в циркуляцию. Цитокины отличаются быстрым катаболизмом, даже при активации их синтеза возможны отрицательные результаты исследования |
А,Б)Основные ограничения - те же, что и предыдущем пункте. В) Необходим культуральный метод, увеличивающий время исследования и экономические затраты
|
Спектр цитокинов |
Интерфероны, провоспалительные цитокины (TNFα, IL-1,6, GM-CSF), реже - другие |
Любые |
Методы |
ИФА (есть стандартные коммерческие тест-системы и протоколы) |
ИФА, молекулярно-биологические методы, проточная цитофлюориметрия, иммуногистохимические |
Пути преодоления ограничений |
Исследование материалов из очага патологического процесса – биоптатов с детекцией цитокинпродуцирующих клеток иммуногистохимическими методами или проточной цитофлюориметрией |
? |
Исследование продукции цитокинов в условиях in vitro осуществляются в соответствии со следующей принципиальной схемой (рисунок 8.1):
Рисунок 8.1 Принципиальная схема исследования продукции цитокинов в условиях in vitro