Определение пролиферативной активности лимфоцитов с регистрацией результатов в мтт-тесте

МТТ-тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток восстанавливать желтую соль тетразолия МТТ (бромид 3-(4,5-диметил- тиазол-2-ил)-2,5-дифенил - 2 тетразолия) до формазана. Мертвые клетки и среда для культивирования способностью к восстановлению МТТ не обладают. Число жизнеспособных клеток прямо пропорционально количеству восстановленного формазана, которое можно определить спектрофотометрически после растворения в органическом растворителе.

Оценка эффекторных функции лимфоцитов

Для иммунодиагностических методов оценки эффекторных функций лимфоцитов характерны те же проблемы, что и для других направлений. Несмотря на широкий спектр возможностей и методических подходов при иммунологическом исследовании имеются реальные сложности получения адекватного материала для исследования и интерпретации полученных результатов. В целом, в настоящее время чаще всего используются ряд методов (таблица 8.2.)

Таблица 7.3.

Основные подходы к исследованию эффекторных функций лимфоцитов в условиях in vitro и in vivo

Уровень оценки	Эффекторные функции лимфоцитов
	Цитотоксичноть лимфоцитов	Активность ГЗТ	Продукция антител
In vivo	Определение спонтанного уровня цитотоксичности, а также количества и активности киллерных клеток по экспрессии специфичных для них маркеров	Внутрикожные пробы с туберкулином и другими антигенами, могут быть использованы и митогены	Решается в рамках серологического или иммунохимического исследования
In vitro	Определение уровня цитотоксической активности в биологических тестах с клетками-мишенями	?	Решается в рамках культурального метода при стимуляции мононуклеаров периферической крови или иного биологического материала с последующей оценкой продукции антител методом ИФА или серологическим

Исследование цитотоксической активности лимфоцитов

NK-лимфоциты активируются под действием ИЛ-2 и интерферона-. ИЛ-2 взаимодействует с рецепторами к нему. При этом происходит пролиферация NK-лимфоцитов, следовательно происходит увеличение их содержания: как в органах, так и периферической крови. Причем, NK-лимфоциты реагируют на минимальные концентрации ИЛ-2 = 0,02 МЕ/мл, а самый ранний ответ наблюдается через 15-30 минут после активации Th₀

Существующие методы оценки активности NK включают в себя:

1. Определение их содержания в периферической крови с помощью иммунофенотипирования с CD16 и CD56 (лимфоцитотоксический тест, иммунофлуоресценция, проточная цитофлуорометрия). Норма CD16 (NK-клетки): взрослые = 9-16% (170-400/мм³); дети до года = 8-17% (300-700/мм³); дети (1-6 лет) = 8-15% (200-600/мм³); дети (7-17 лет) = 9-16% (200-300/мм³).

2. Регистрация пролиферации под действием минимальной концентрации экзогенного ИЛ-2 (0,1 МЕ/мл) в течение первых 12-ти часов культивирования

3. Определение активности NK, основанное на оценки их киллинговой активности: методом ИФА определяется -инф, который способен увеличивать синтез перфоринов в гранулах NK.

4. Определение цитотоксической активности NK определяют по их способности лизировать клетки-мишени (инфицированные вирусами, опухолевые или аллогенные клетки). Существует 2 разновидности методов, основанных на разрушении (киллинге) специфического клона клеток К-562 (клеток миелоидного лейкоза): радиоизотопный метод и с помощью камер Перфильева.