Литература
1. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. – М.- Витебский мединститут, 1996. – 282 с.
2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.
3. Лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса факультета экологической медицины: практикум.// Романовская Т.Р., Пивень Н.В., Мельникова Я.И. и др. – МГЭУ им. А.Д. Сахарова, 2006 – 44 с.
4. Givan AL. Principles of flow cytometry: an overview. Methods Cell Biol. 2001;63:19-50.
Лабораторная работа № 5. Исследование функциональной активности нейтрофилов
Цель работы: закрепление теоретического материала по изучаемой теме, освоение методов оценки функциональных свойств нейтрофилов.
Оборудование, приборы, принадлежности: микроскоп, холодильник, термостат, автоматические дозаторы с наконечниками, центрифужные пробирки, предметные стекла, камера Горяева, буферные растворы, 3 % уксусная кислота с добавлением метиленового синего, краситель Романовского-Гимзы, нитросиний тетразолий.
Сведения из теории
Оценка функциональных параметров нейтрофилов имеет значение при частых рецидивирующих гнойных воспалительных процессах, длительно не заживающих ранах, развитии послеоперационных осложнений, при подозрении на наличие иммунодефицита, связанного с нарушением функций этих клеток. Следует учитывать, что функциональные свойства нейтрофилов тесно связаны с активностью компонентов комплемента, концентрацией иммуноглобулинов, наличием факторов опсонизации.
Так как основная функция нейтрофилов – это фагоцитоз, представляющий собой динамический стадийный процесс, то в настоящее время разработаны отдельные методы для определения параметров большинства стадий фагоцитарной реакции или функций нейтрофилов, определяющих ту или иную стадию (рисунок 5.1).
Рисунок 5.1 Основные стадии фагоцитарной реакции
Интегральной характеристикой функционального состояния нейтрофилов является оценка их фагоцитарной активности in vitro на основании определения фагоцитарное индекс Гамбургера, фагоцитарного числа Райта, коэффициента фагоцитарного числа и опсонического индекса поглощения. Тем не менее, выявление дисфункций отдельных этапов фагоцитоза также может иметь диагностическое значение. Для этого оценивают такие параметры как адгезивная, миграционная и метаболическая активность, хемилюминесцентной способности, скорость поглощения кислорода и ее изменение в тестах со специфической лекарственной нагрузкой.
Исследование адгезивной активности нейтрофилов
Межклеточная адгезия и, следовательно, адгезивные молекулы играют важную роль при различных физиологических и патологических процессах, таких как эмбриогенез, рост тканей, регенерация, иммунологические реакции. С участием адгезивных молекул происходит, в частности, взаимодействие нейтрофилов с клетками сосудистого эндотелия. Оценка способности нейтрофилов к адгезии имеет значение при септических и тяжелых воспалительных состояниях, поскольку повышенная адгезия нейтрофилов к эндотелию стимулирует высвобождение повреждающих его токсичных субстанций; при подозрении на иммунологическую недостаточность, связанную с дефектом молекул адгезии. Исследование выполняют следующим образом:
1. Готовят суспензию нейтрофилов в культуральной среде в концентрации 2×106 кл/мл.
2. Для каждого исследования используется 9 лунок плоскодонного 96-луночного планшета. В первую по шестую лунки вносят по 10 мкл раствора Хенкса (без Са2+ и Мg2+) (фоновая оптическая плотность и спонтанная активность клеток), в седьмую по девятую – по 10 мкл раствора стимулятора, например, PMA (стимулированная активность клеток).
3. Суспензию НФ вносят в каждую из подготовленных лунок по 90 мкл/лунку.
4. Клетки инкубируют при 37˚С в течение 60 минут в атмосфере с 5% СО2.
5. Лунки с 4-й по 9-ю (т.е. кроме лунок для определения фоновой оптической плотности) три раза осторожно промывают холодным (Т=4˚С) раствором Хенкса (без Са2+ и Мg2+) для удаления не адгезировавшихся клеток.
6. Планшет высушивают и проводят фиксацию и окраску клеток в течение 10 минут, добавляя 100 мкл раствора 0,5% кристаллического фиолетового в метаноле во все лунки.
7. Краситель удаляют, лунки тщательно промывают физиологическим раствором, высушивают на воздухе.
8. Клеточный монослой лизируют внесением по 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного соляной кислотой до 0,04 М концентрации последней.
9. Измеряют оптическую плотность всех лунках при длине волны 540 нм.
10.Вычисляют среднюю оптическую плотность для каждого триплета.
11. Вычисляют процент адгезировавшихся клеток в спонтанном и стимулированном вариантах теста, по отношению к фоновой оптической плотности, взятой за 100%. Результаты можно выражать так же в абсолютных показателях при расчете количества клеток, внесенных в лунку.
12.Вычисляют индекс стимуляции, как отношение количества адгезировавшихся клеток в присутствие стимулятора к количеству адгезировавшихся клеток в отсутствие стимулятора.
Нормальные значения: спонтанная активность – 40-55%; стимулированная активность – 70-80%; индекс стимуляции – 1,2-2 [10].