Лабораторная работа №6. Определение гаплотипа главного комплекса гистосовместимости

Цель работы: закрепление теоретического материала по изучаемой теме, овладение навыками работы с оснащением для постановки лимфоцитотоксического теста, освоение лимфоцитотоксического теста.

Оборудование, приборы, принадлежности: микроскоп, холодильник, термостат, планшеты Терасаки, микрошприц, автоматические дозаторы с наконечниками, буферные растворы, антисыворотки к молекулам МНС, трипановый синий, вазелиновое масло, исследуемые образцы лимфоцитов.

Сведения из теории

Типирование молекул и/или генов ГКГС представляет собой чрезвычайно важную задачу, позволяющую решить ряд иммунодиагностических проблем. Типирование ГКГС используют в трансплантологии, при диагностике аутоиммунных заболеваний, а также в научно-исследовательских целях (при исследовании процессов эволюции и становления рас и народностей), причем варианты типирования ГКГС различны как по определяемым параметрам, так и по решаемым задачам:

Таблица 6.1

Области применения типирования молекул и генов главного комплекса гистосовместимости

Области медицины Показатели	Трансплантология	Диагностика аутоиммунных заболеваний
Спектр определяемых параметров	Типирование проводится в отношении максимально большого количества определяемых молекул/генов ГКГС	Проводится определение лишь тех конкретных молекул ГКГС, которые связаны с развитием диагностируемого заболевания
Решаемые задачи	Позволяет определить совместимость пары донор-реципиент и минимизировать возможность развития отторжения трансплантата	Позволяет определить генетическую предрасположенность к развитию заболевания, либо подтвердить диагноз

Методы типирования антигенов HLA (или ГКГС человека) условно можно разделить на 2 группы: оценка антигенной специфичности молекул HLA (А) и и идентификация локусов генов, характерных для индивидуума (В), в соответствии рисунком 6.1.

А.Определение антигенов HLA реципиента:

1.Серологические методы

Основной серологический метод типирования антигенов HLA – лимфоцитотоксический тест. Метод заключается в следующем: 1) к сывороткам против разных антигенов HLA добавляют по 2000 исследуемых лимфоцитов; 2) после инкубации добавляют комплемент (его источником может служить кроличья сыворотка); 3) лимфоциты, несущие антиген, против которого направлена сыворотка, под действием комплемента разрушаются; 4) затем к лимфоцитам добавляют краситель, который окрашивает только живые клетки. Результат оценивают по относительному числу погибших лимфоцитов. Основным недостатком является большой требуемый объем крови: для типирования антигенов класса I необходимо не менее 15 мл, а для типирования антигенов класса II – не менее 30 мл крови. Получение диагностических сывороток – трудоемкий и дорогостоящий процесс. Он сводится к исследованию большого количества проб сывороток от многорожавших женщин с помощью панелей лимфоцитов, типированных по антигенам HLA. Особенно трудно получить сыворотки к редким антигенам HLA. При оценке результатов серологического типирования антигенов HLA необходимо учитывать, какая лаборатория его проводила и качество используемых сывороток. Наименее доступны сыворотки к антигенам HLA класса II, особенно к антигенам HLA-DP.

Все варианты постановки тестов на комплементзависимую цитотоксичность (лимфотоксичность) основаны на использовании микротехники, предложенной американским исследователем П. Терасаки: шестиствольный шприц для раскапывания сывороток, шприц для раскапывания комплемента, одноствольный шприц с диспенсером, планшет Терасаки, планшет Меллера для техники двойной флуоресцентной окраски. Пластиковые микропробирки для разлива сывороток (1 мл) и комплемента (2 мл).