Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Нарисуйте схему лимфоцитотоксического теста.

2. Проведите лимфоцитотоксический тест для определения специфичностей молекул HLA по предложенному протоколу:

а) выделение лимфоцитов проводят по стандартной методике (см. лаб. раб. №2),

б) типирующие сыворотки раскапывают (5 мкл) в лунки планшетов Терасаки под вазелиновое масло и замораживают при -20º С до момента использования; перед использованием размораживают при комнатной температуре,

в) лимфоцитарную взвесь раскапывают микрошприцем Терасаки (№705) в планшеты по 1 мкл (2000 клеток) на лунку и инкубируют при 22º С 30 мин вместе с типирующей сывороткой,

г) в каждую лунку добавляют по 5 мкл свежеразмороженного кроличьего комплемента и инкубируют при комнатной температуре 1 час,

д) резко стряхивают планшеты для удаления вазелинового масла и закапывают в каждую лунку 1 µл трипанового голубого; через 10 мин избыток краски удаляют стряхиванием и учитывают реакцию; клетки, «убитые» цитотоксическими антителами, окрашены в голубой цвет и имеют нечеткие контуры вследствие начавшегося лизиса.

Интенсивность цитотоксической реакции оценивают по следующей шкале:

8 – 100 – 81% гибель клеток – сильно выраженная положительная реакция

6 – 80 – 41% гибель клеток – выраженная положительная реакция

4 – 40 – 31% гибель клеток – положительная реакция

2 – 30 – 20% гибель клеток – сомнительная реакция

1 – 20 – 0% гибель клеток – отрицательная реакция

0 – реакция не читаема

Содержание отчета. Зарисуйте необходимые схемы, микросокипические препараты лунок планшета Терасаки. Приведите расчетные показатели. Проанализируйте ситуации, в которых возможны полученные результаты

Контрольные вопросы

1. Генетическая карта главного комплекса гистосовместимости. Номенклатура. Обеспечение полиморфизма генов и молекул МНС на уровне индивидуального организма и популяции организмов. Строение молекул МНС I и II классов. Функции.

2. Различия в экспрессии на разных типах клеток и тканей

Литература

1. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. – М.Ж Медицина, 1983, 208 с.

2. Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell. Molecular Cell Biology, 5th Edition, ©2003 W. H. Freeman & Co.

Лабораторная работа №7. Исследование цитотоксической и пролиферативной активности лимфоцитов

Цель работы: закрепление теоретического материала по изучаемой теме, овладение навыками культурального метода, постановки цитотоксического и пролиферативного тестов.

Оборудование, приборы, принадлежности: микроскоп, холодильник, СО₂-инкубатор, центрифуга, автоматический счетчик клеток, ИФА-ридер, ламинарный бокс, автоматические дозаторы с наконечниками, буферные растворы и питательные среды, митогены или иные активаторы лимфоцитов, трипановый синий, исследуемые образцы лимфоцитов.

Сведения из теории

Существует большое количество методов оценки функциональной активности лимфоцитов [9]. Как правило, методы оценки функциональных свойств лимфоцитов, отличаются необходимостью значительного количества клеток, длительностью исследования, требуют специального оборудования. В то же время, диагностическое значение получаемой информации не всегда адекватно поставленным задачам, что связано с особенностями доступных для исследования лимфоцитов (см. практическое занятие 1). В силу данных причин введение многих методик оценки функциональных свойств в иммунодиагностическую практику затруднено, а спектр научно-исследовательских методов более обширен. В настоящее время оценка функциональных свойств лимфоцитов в рамках иммунодиагностики включает три основных направления, обладающих собственной диагностически значимой информацией (таблица 7.1):

Таблица 7.1