Реакция розеткообразования

Самая первая реакция иммунофенотипирования это реакция розеткообразования. В настоящее время комплекс реакций розеткообразования выводится из иммунодиагностической практики. К её положительным чертам относятся простота, отсутствие необходимости в дорогостоящем оборудовании и невысокая стоимость. Однако розеткообразование в качестве процедуры иммунофенотипирования позволяет определить лишь незначительное количество мембранных рецепторов, специфичность, воспроизводимость полученных результатов невысоки, а следовательно и диагностическая информация не отличается значимостью. В то же время реакции розеткообразования сохраняют свое значение при проведении экспериментальных исследований в области иммунологии в качестве процедуры сепарации ИКК. Так, если суспензию Е-РОК наслоить на градиент плотности фиколл-верографин и подвергнуть центрифугированию, то на дно пробирки седиментируют лишь Т-лимфоциты, экспрессирующие маркер CD2. Другие популяции лимфоцитов будут задерживаться в интерфазе. Соответственно, такой подход позволяет провести выделение клеток в виде гомогенной популяции. Кроме этого, возможности реакций розеткобразования могут быть расширены. Дело в том, что истинное розеткообразование характерно лишь для двух типов RBC и, соответственно, позволяет выявить только два рецептора. Но RBC можно использовать в качестве пассивного носителя АТ к рецепторам, помогающего визуализации взаимодействия рецептор-АТ к нему. Так были разработаны реакции розеткообразования для выявления рецептора к комплементу на В-лимфоцитах (ЕАС-РОК: Е-эритроцит, А-антитело к эритроциту, С- комплемент), рецептора к Fc-фрагменту IgG (Fс-РОК) и Fc-фрагменту IgM (Fс-РОК), характерных для Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов и В-лимфоцитов. Эта же реакция оказалась полезной для определения числа В-лимфоцитов, несущих Ig разной классовой принадлежности. Во всех этих реакциях требуется подготовка RBC. Она заключается в сенсибилизации RBC антисывороткой (в субагглютинирующих разведениях!), см. ниже.

Реакция комплементзависимого цитолиза

В тех случаях, когда неспецифическая сорбция АТ к рецепторам на RBC была не­возможной, была предложена методика учета по цитолитическому эффекту. Для этого после взаимодействия клетка - АТ к рецептору в систему вносят комплемент. Комплемент активируется, результатом чего становится лизис тех лимфоцитов, которые обладают соответствующими рецепторами. Микроскопиче­ски определяют число (или процент) поврежденных клеток.

Достоинства перечисленных методик - возможность применения без дорогостоящих реактивов и оборудования. В качестве антисывороток можно использовать даже антисыворотки к Ig, выпускаемые для реакции иммунодиффузии. Недостатки - трудоемкость, субъективный учет, ограниченность числа определяемых рецепторов и, как указано выше – низкая воспроизводимость и большое количество ложных результатов.

Этих недостатков лишены реакции, в которых используются МАТ. Надо иметь в виду, что для регистрации взаимодействия клетка - МАТ также необходима какая-нибудь метка. В зависимости от метода учета в качестве меток используют: флуорохромы (FITC, PE и др. - см. таблицу 4.2), ферменты (щелочная фосфатаза, например), ферритин, золото и др. В иммунологии наиболее широко применяются флуорохромы и ферменты (при иммунофлуоресцентном методе и иммуноферментном анализе соответственно). Другие способы учета (с помощью электронного микроскопа и др.) применяются в научных целях, обычно не связанных с иммунофенотипированием.

Таблица 4.2