Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Проведите нст-тест для определения метаболической активности нейтрофилов, рассчитайте средний цитохимический коэффициент согласно приведенному протоколу.

а) в 2 лунки 96-луночного плоскодонного планшета для каждого исследования вносят по 10 мкл раствора стимулятора (например, РМА в конечной концентрации 100 нг/мл). Для постановки спонтанного варианта теста в 2 другие лунки вносят по 10 мкл раствора Хенкса (без Са²⁺ и Мg²⁺),

б) во все лунки вносят по 40 мкл раствора НСТ в концентрации 0,25 %.

в) во все лунки добавляют по 50 мкл клеточной суспензии в концентрации 2×10⁶ кл/мл в полной культуральной среде,

г) тщательно ресуспендируют и инкубируют при 37˚С в течение 30 минут в атмосфере с 5% СО₂. При микроскопическом варианте учета НСТ-теста возможно использование цельной крови, и постановка реакции не в планшете, а в центрифужных пробирках.

Результаты реакции регистрируют спектрофотометрически или микроскопически.

Спектрофотометрический метод:

а) после инкубации планшеты центрифугируют при 150g в течение 5 минут и удаляют надосадочную жидкость,

б) лунки промывают раствором Хенкса (без Са²⁺ и Мg²⁺) (Т=4˚С) и двумя сменами 96% этанола (Т=4˚С), центрифугируя после каждой отмывки планшет при 400g в течение 7 минут,

в) планшет высушивают и клетки разрушают внесением в каждую лунку по 120 мкл 2М раствора гидроксида калия и 140 мкл 99% ДМСО,

г) проводят спектрофотометрию при длине волны 620 нм,

д) полученные единицы оптической плотности пересчитывают на количество образовавшегося диформазана согласно калибровочной кривой зависимости оптической плотности раствора от концентрации диформазана. Результаты выражают в количестве микромолей образовавшегося диформазана в объеме раствора на 10⁹ клеток за 30 минут инкубации. Вычисляют ИС, равный отношению количества образовавшегося диформазана при инкубации клеток в присутствии стимулятора к количеству диформазана, образовавшегося в отсутствие стимулятора.

Нормальные значения: спонтанная активность – 4-6 мкМ формазана/литр на 10⁹ клеток в 30 минут, стимулированная активность – 5,5-8 мкМ формазана/литр на 10⁹ клеток в 30 минут, индекс стимуляции – 1,2-2.

Микроскопический учет теста:.

а) после этапа инкубации пробирки центрифугируют 5 мин при 400g, после чего удаляют надосадок удаляют и снимают нейтрофильную пленку, осевшую на слое эритроцитов (при использовании цельной крови),

б) полученные клетки ресуспендируют и готовят мазки, которые фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе,

в) подсчитывают 100 нейтрофилов, определяют количество положительных по НСТ клеток и степень заполнения цитоплазмы гранулами формазана, образовавшегося в клетках. Рассчитывают средний цитохимический коэффициент:

СЦК=((А×0)+(В×1)+(С×2)+(D×3))/(А+В+С+D), (5.1)

где А – количество клеток без гранул, В – количество клеток с числом гранул от 1 до 3, С – количество клеток с числом гранул от 3 до 8, D – количество клеток с числом гранул больше 8. Необходимо подсчитать не менее 100 клеток ((А+В+С+D)≥100).

Нормальные значения: НСТ клетки – 8-12%, СЦК =0,06-0,14, индекс стимуляции =1,2-2

2. Решите предложенные задачи. Оцените ситуации, в которых возможны полученные результаты.

Содержание отчёта. Зарисуйте необходимы схемы, проведите расчеты показателей НСТ-теста. Решение задач с заключениями приведите в письменном виде.

Контрольные вопросы

1. Структура и функции нейтрофилов. Особенности нейтрофилопоэза.

2. Регуляция функциональной активности нейтрофилов

3. Особенности и отличия макрофагального и нейтрофильного фагоцитоза.

4. Физиологическое и патофизиологическое значение фагоцитоза.

Литература

1. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. – М.- Витебский мединститут, 1996. – 282 с.

2. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. – М.: Медицина, 1987, 472 с.

3.Гребенюк А.Н., Антушевич А.Е., Беженарь В.Ф. Нейтрофилы и экстремальные воздействия, СПб., 1998.-216с.

4. Кетлинский С. А, Калинина Н. М. Иммунология для врача. С.-П.: Наука, 1998. 142-143с.