П ротокол постановка прямой риф (с регистрацией на цитофлуориметре)

Реакцию проводят на выделенной из крови суспензии мононуклеаров в концентрации 2,5-5,0×10⁶ клеток/мл или с использованием цельной крови.

1. В пластиковую пробирку (12×75 мм) вносят 100 мкл крови, добавляют 10 мкл МАТ, меченных флуорохромом, тщательно перемешивают и инкубируют в темноте при комнатной температуре 30 минут.

2. В образец вносят лизирующий RBC раствор (0,84 М NH₄Cl в буферном растворе) на 3 – 5 минут, затем добавляют 2 мл PBS.

3. Центрифугируют пробирку, отбирают супернатант, а к осадку клеток добавляют 0,5 мл 2% раствора параформальдегида.

4. Регистрируют реакцию на проточном цитофлуориметре.

Методические указания к выполнению лабораторной работы

1. Проведите сенсибилизацию RBC барана антителами к ним же классовой принадлежности IgG, IgM: 1% суспензию RBC в 0,15 М растворе NaCl смешивают с равным объемом соответствующей антисыворотки (коммерческий или приготовленный в лаборатории препарат), инкубируют при +37 °С в течение 30 минут, затем проводят 3-кратную отмывку для удаления несвязавшихся АТ и разрушившихся RBC, готовят 1 % суспензию и используют её для постановки теста розеткообразования.

2. Поставьте реакцию Е-розеткообразования для определения Т-Л, осуществите сепарацию Е-РОК на градиенте плотности, проведите лизис RBC и подготовьте суспензию Т-клеток для постановки Fcμ- РОК и Fсγ-РОК. Зарисуйте ход реакции и схему образования РОК. Проведите микроскопический учет реакции розеткообразования.

3. Поставьте предложенный вариант РИФ для иммунофенотипирования лимфоцитов МАТ по представленному протоколу (с регистрацией результатов микроскопическим методом).Выделение лимфоцитов проводиться по стандартной процедуре (см. лаб. раб. №1).

Постановка непрямой РИФ

Для постановки реакции используются специальные предметные стекла с полимерным покрытием, в котором проделаны лунки. Инкубацию проводят во влажной камере

1. В лунки обезжирены смесью Никифорова стёкол внести по 10 мкл 3% глютарового альдегида. Поместить в термостат на 30 мин.

2. Отмыть стекло в PBS дважды, лунки оставив влажными.

3. Внести в каждую лунку по 10 мкл суспензии исследуемых клеток (1-2×10⁶ клеток/мл). Инкубировать клетки 30 мин при 37^оС.

4. Промыть стекла в PBS. Внести в каждую лунку по 10 мкл МАТ. Инкубировать 30 мин при 20^оС.

5. Отмыть стекла трижды в PBS по 1 мин. Внести в каждую лунку по 10 мкл рабочего раствора FITC-конъюгатов вторичных антител. Инкубировать клетки 30 при 4^оС

6. Отмыть стекла трижды в PBS по 1 мин. В каждую лунку внести по 10 мкл 50% раствора PBS на глицерине. Покрыть препарат покровными стеклами, обезжиренными в смеси Никифорова. Препарат можно хранить в холодильнике 24-48 часов или подсчитать клетки немедленно. Подсчитать клетки в флуоресцентном микроскопе: на 100 клеток учитываются как светящиеся, так и несветящиеся.

Содержание отчёта

Зарисуйте необходимые схемы и микроскопические изображения розеткообразующих клеток. Приведите расчетные данные по полученным результатам.

Контрольные вопросы

1. Субпопуляционная дифференцировка ИКК на основе мембранных рецепторов

2. Функции основных мембранных рецепторов лимфоцитов. Основные стадии лимфопоэза и смена мембранных маркеров лимфоцитов в процессе лимфопоэза и иммуногенеза