Количественное определение IgG1 в сыворотке крови (определение других изотипов IgG проводится аналогично с помощью соответствующих тест-систем)
Для углубленной оценки гуморального иммунитета определяют уровень подклассов IgG. Хотя в большинстве случаев изменение уровня подклассов IgG не сопровождается выраженными клиническими проявлениями, у больных с рецидивирующими инфекциями относительное содержание подклассов IgG значительно отличается от нормы. При этом общий уровень IgG и других Ig может быть нормальным. Определение субклассов может проводиться с использованием любого из вышеперечисленных видов иммуноанализа, но наиболее часто применяется твердофазный ИФА.
Для определения концентрации субклассов IgG1 в сыворотке крови мы используем вариант двухцентрового ИФА. В качестве АГ используется стандартный препарат IgG1 человека. Высокоспецифичыне МАТ к IgG1 человека иммобилизуются с помощью физической сорбции на поверхности твердой фазы (иммунологический полистирольный планшет) в соответствии с рисунком 4.5. Специфические АТ к IgG1 определяются с помощью калибровочной кривой, для построения которой известные количества стандартных IgG1 вносятся в лунки полистирольного планшета и образуют комплексы с анти- IgG1 антителами на твердой фазе. Образующиеся на твердой фазе комплексы «анти-IgG1 – IgG1» проявляются с помощью конъюгата кроличьих АТ к суммарной фракции иммуноглобулинов IgG1 человека, меченых пероксидазой хрена. Последующая инкубация с хромогенными субстратами пероксидазы приводит к развитию интенсивного окрашивания, плотность которого определяется спектрофотометрически. Исследуемые пробы разведенной сыворотки крови человека анализируют аналогично калибровочным пробам. Количество специфических IgG1 антител в исследуемых пробах определяют с помощью калибровочной кривой, используя полученные значения оптической плотности в исследуемой пробе.
Методические указания к выполнению лабораторной работы
Изобразите графически молекулярную схему иммуноферментного анализа.
Выполните ИФА в соответствии с приведенным протоколом (используя полученные данные, постройте калибровочный график и рассчитайте концентрацию антител в анализируемых образцах сыворотки крови по предложенной формуле):
А. Приготовление реагентов
Иммобилизация анти- IgG1 антител
В лунки полистирольного планшета вносится раствор анти- IgG1 антител в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (Na-ФСБ), в количестве 200 мкг на лунку и инкубируется в течение 24 часов при температуре +4оС. Несорбированный АГ удаляется трехкратным промыванием планшета дистиллированной водой.
Приготовление калибровочных проб
Лиофилизованный препарат человеческих иммуноглобулинов G13у разводится дистиллированной водой до концентрации 5 мкг в мл и из него готовятся кратные разведения, согласно следующей схеме:
Стандарт 500 нг 500 мкл исходного раствора + 500 мкл буфера
Стандарт 250 нг 500 мкл стандарта 500 + 500 мкл буфера
Стандарт 100 нг 500 мкл стандарта 250 + 750 мкл буфера
Стандарт 50 нг 500 мкл стандарта 100 + 500 мкл буфера
Стандарт 25 нг 500 мкл стандарта 50 + 500 мкл буфера
Стандарт 0 нг* 500 мкл буфера
*Данный стандарт используется для контроля уровня неспецифического связывания