Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
uchebno_metodicheskoe_posobie_po_uglevodam_17.0...doc
Скачиваний:
45
Добавлен:
29.08.2019
Размер:
2.22 Mб
Скачать

4.2. Методические указания к лабораторным работам

№1: Определение активности ЛДГ в тканях или сыворотки крови.

№2: Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани.

Работа № 1. Определение активности ЛДГ в сыворотке крови.

Принцип метода основан на определении скорости снижения реакции катализируемой ЛДГ. Спектрофотометрическое определение оптической плотности при окислении НАДН2 в НАД+ проводят при длине волны 340 нм (тест-Варбурга).

ПВК + НАД·Н + Н+ ← лактатдегидрогеназа → МК + НАД+

Скорость падения Е (оптической плотности) пропорциональна снижению концентрации НАДН и активности ЛДГ.

Ход работы: Настроить спектрофотометр на длину волны 340 нм. В чистую пробирку внести ниже перечисленные реактивы, затем перелить их в кювету спектрофотометра и через 30 секунд снимать показания прибора начиная с Ео через каждую минуту, в течение 3 минут.

Реактивы реакционной смеси:

  1. Фосфатный буфер - 2,5 мл.

  2. Сыворотка крови - 0,1 мл.

  3. Р – р. НАДН - 0,1 мл.

  4. Р. – р. ПВК - 0,1 мл.

Расчет:

Из полученных в ходе измерений трех Ес (экстинций), найти среднее значение (Е/мин.), которое умножить на коэффициент пересчета в международные единицы (U/л) – 8095.

U/л = 8095 х Е/мин.

Если полученный результат разделить на 16,67, то получим результат в нмоль/л.

В норме активность ЛДГ в сыворотке крови, замеренная при комнатной температуре, находится в пределах 120 – 240 U/л.

Работа № 2. Определение содержания молочной кислоты в сыворотке крови.

Принцип метода: Определение молочной кислоты основано на реакции катализируемой ЛДГ (см. выше) и тесте-Варбурга – спектрофотометрической регистрации прироста НАДН при длине волны 340 нм, эквимолярному окисленной молочной кислоте.

Ход работы:

1.Этап. Получение безбелкового экстракта молочной кислоты.

В центрифужную пробирку отмерить 0,5 мл. крови (сыворотки) и 1 мл 0,6 М хлорной кислоты. Через 5 мин. инкубации осадить белки центрифугированием при 5 тыс.об/мин., в течение 5 минут. Полученную надосадочную жидкость слить в чистую пробирку и использовать для исследования в следующем этапе.

2.Этап. Запуск реакции и инкубирование.

Приготовить реакционную смесь (табл. 4)

Таблица 4. Приготовление реакционной смеси

Реагенты (мл).

Пробирки

Опыт

Контроль

Буферный раствор

2,0

2,0

Хлорный экстракт

0,2

-

Р – р. НАД

0,1

0,1

Р – р. хлорной кислоты

-

0,2

Инкубирование провести в термостате при 39 градусах, в течение 30 минут.

3.Этап. Спектрофотометрирование.

Содержимое пробирок опыта и контроля поочередно перелить в чистые кюветы и снять показания экстинций с прибора при длине волны 340 нм., против воздуха.

4.Этап. Расчет: Еоп – Ек = Е

С ммоль/л = Е х 10535 , где 10535 – коэффициент пересчета в ммоль/л.

В нормальной венозной сыворотке крови содержание молочной кислоты находится в пределах – 0,6 – 1,6 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение: Определение активности ЛДГ и содержания молочной кислоты в сыворотке крови широко используется в клинической практике для характеристики функционального состояния гликолиза, тканевого дыхания и проницаемости клеточных мембран. Так при снижении или полном прекращении поступления кислорода в ткани, при ингибировании или структурном повреждении ферментов тканевого дыхания происходит повышение обоих биохимических показателей. Однако при большинстве патологических состояний повышенная активность гликолиза и проницаемость мембран сочетаются и это приводит к более резкому увеличению концентрации МК и активности ЛДГ, например, при воспалительных процессах в почках, мышцах, ишемии тканей и т.д.

Существуют патологические состояния, когда наоборот, активность гликолиза снижается - при гипогликемических состояниях, дефиците регуляторных факторов, стимулирующих гликолиз или при его ингибировании.

Соседние файлы в предмете Биохимия