Контрольні питання

1. Які матеріали необхідні для виготовлення бактерійних препаратів-мазків;

2. Які розчини використовують для фарбування бактерій;

3. Методи фіксації бактерійних препаратів і їх призначення;

4. Засоби обробки предметного скла;

5. Техніка фарбування бактерій простим методом;

6. Правила сушіння препаратів;

7. Вимоги до взяття бактеріальної культури для виготовлення мазку;

8. Методика нанесення бактеріальної культури на предметне скло, взятої з щільного і рідкого поживного середовища.

Заняття № 3

ТЕМА: Складні і спеціальні методи фарбування мікроорганізмів.

МЕТА ЗАНЯТТЯ: Навчити студентів фарбуванню мікробів складним методом за Грамом та спеціальним методам фарбування спор і капсул.

ЗМІСТ ЗАНЯТТЯ

Викладач проводить опитування студентів-по минулому та наступному матеріалу, демонструє метод фарбування бактерій за_; Грамом, спор методом Пешкова, капсул за методом Бурі та пояснює їх сутність.

САМОСТІЙНА РОБОТА СТУДЕНТІВ

Кожен студент:

1. вивчивши методику фарбування мікробів за Грамом спор за Пешковим, капсул за Бурі, готує мазки з чистих культур і проводить фарбування;

2. мікроскопічну картину замальовує в зошиті, підписує під малюнками назви бактерій на латинській мові.

ОСНАЩЕННЯ ЗАНЯТТЯ

Забезпечити кожного студента:

-мікроскопом, предметним склом, пальником, бактеріологічною петлею, практикум по мікробіології;

Забезпечити кожні 2 людини:

- фільтрувальним папером ,імерсійною олією, промивалкою з ванною,

олівцем по склу, фарбуючими розчинами та реактивами (генціанвіолет у вигляді смужок фільтрувального паперу; розчин Люголя, 96% спирт, карболовий фуксин, метиленова синька, 0,5% водний розчин нейтральроту, склянка з дезинфікуючим розчином) Забезпечити підгрупу студентів:

- трьома пробірками з грамнегативною (Асеcоbаctег асеti), грам позитивною культурою (Вас.subtilis), спороутворюючою:(Bас. micoides), капсулоутворюючою (Вас. musilaginosus , або. Azotobacter)

Студенти повинні мати кольорові пасти: (синього, червоного, кольору)

МЕТОДИКА ВИКОНАННЯ ЗАВДАННЯ

Складні та спеціальні засоби фарбування бактерій засновані на властивостях фізико-хімічної будови мікробної клітини. Вони використовуються для диференціації мікроорганізмів та вивчення їх кліткової структури.

В зв'язку з тим, що хімічний склад: цитоплазми, і оболонки мікробів відрізняється, вони по-різному сприймають одну і ту ж фарбу та неоднаково віддають їх при наступному знебарвленні спиртом, кислотами. Різні частини мікробної клітини вибірково реагують на дію фарбуючих розчинів.

Методика фарбування за Грамом. На знежирене предметне скельце поділене на дві частини наносять окремо грампозитивні та грамнегативні мікроорганізми. Мазки висушують та фіксують; .На препарат наносять смужку фільтрувального паперу з генціанвіолетом на 2 хвилини, знімають папір пінцетом, і наливають розчин Люголя на 2 хвилини. Після цього розчин зливають і обробляють 96% етиловим спиртом протягом ЗО секунд, похитуючи. Змивають водою і фарбують карболовим фуксином 2 хвилини. Фарбу змивають, препарат, висушують фільтрувальним папером і мікроскопують.

Грампозитивні мікроби забарвлюються в синьо-фіолетовий колір, грамнегативні в червоний колір.

Сутність методу фарбування за Грамом. Вона заснована на особливостях фізико-хімічної будови мікробної клітини.

Грампозитивні мікроби містять в клітинній стінці поліпептид муреін, у цитоплазмі магнієву сіль РНК, які з генціанвіолетом в присутності йоду, а також кислої реакції (рН- 2-3) цитоплазми утворюють стійкий комплекс (спиртонерозчинний), що зберігається при послідуючому впливу спирту і карболового фуксину, залишаються зафарбованими у синьо-фіолетовий колір.

Грамнегативні мікроорганізми не містять вище переліковані компоненти в оболонці і протоплазмі клітини, або містять в невеликій кількості, тому в них не утворюється стійке з'єднання фарби з оболонкою і протоплазмою, в результаті чого вони знебарвлюються спиртом. При додатковому фарбуванні карболовим фуксином, вони сприймають червоний колір фуксину.

Фарбування спор за Пєшковим. Спори - це овальні світлозаломлюючі тільця, які утворюються всередині клітини при несприятливих умовах. Вони мають щільну багатошарову оболонку (3-5 шарів), тому простим-засобом не фарбується. Для їх фарбування застосовуються спеціальні методи, які засновані на попередньому руйнуванні оболонок, шляхом протравлення (хромовою, карболовою, соляною кислотами), чи підігрівання на полум'ї спиртівки.

Одним із методом фарбування спор є засіб Пешкова. На зафіксований препарат наносять метиленову синьку і тримають над полум'ям спиртівки протягом 15-20 секунд, доводять до кипіння. Потім фарбу змивають водою, після чого додатково фарбують 0.5% водним розчином нейтральроту 30 секунд, змивають водою і проводять мікроскопію. Спори фарбуються в блакитний або синій колір, вегетативні форми в рожевий.

Фарбування капсул за методом Бурі. На зафіксований препарат наносять краплину чорної туші розбавленої 1:1 водою, підсушують та розглядають з імерсією. На темному фоні видно прозоре тіло клітини та сіруватого кольору капсулу.

КОНТРОЛЬНІ ПИТАННЯ.

1. Складові частини бактеріальної клітини;

2. Устрій клітинної оболонки бактерій

3. Яке значення в мікробіології має метод фарбування мікробних клітин за Грамом?

4. Сутність методу фарбування мікробів за Грамом

5. Які фарби і розчини застосовуються при методі фарбування за Грамом? Техніка фарбування мікробів за методом Грама;

6. Спори бактерій і умови при яких вони утворюються;

7. Сутність фарбування спор і капсул мікроорганізмів;

8. Методи фарбування спор і капсул.

Заняття № 4