Справочный материал для оформления протоколов
Принцип ПЦР
Первый этап амплификации системы ПЦР – это тепловая денатурация образца ДНК в результате повышения температуры в реакционной пробирке до 95°С. Кроме исходной ДНК, в реакционной пробирке содержится избыточное количество двух нуклеотидных праймеров, термостабильная ДНК-полимераза (Taq ДНК-полимераза, выделенная из бактерий Termus aquticus) и четыре дезоксирибонуклеотида. Высокая температура поддерживается в течение 1 мин.
На втором этапе температура в смеси медленно понижается до 55°С. На этом этапе праймеры спариваются с комплементарными им последовательностями в исходной ДНК.
На третьем этапе температура поднимается до 75°С, являющейся оптимальной для каталитической активности Taq ДНК-полимеразы. Синтез ДНК инициируется с 3-гидроксильного конца каждого праймера.
Продукты ПЦР выявляются с помощью электрофореза в агарозном геле.
занятие №16
Микробный антагонизм. Антибиотики
Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Практическое использование бактериоциногении
Вопросы для подготовки
1. Микробный антагонизм, определение понятия, его формы, биологическое значение и методы выявления. Примеры.
2. Бактериоцины, как факторы внутривидового антагонизма и персистенции. Примеры.
3. Использование бактериоциночувствительности бактерий как эпидемиологического маркера для установления идентичности культур различного происхождения.
4. Антибиотики, определение понятия, способы получения. Требования, предъявляемые к антибиотикам. Примеры.
5. Классификация антибиотиков по происхождению, химическому составу, эффекту и спектру действия.
6. Механизмы действия антибиотиков на микроорганизмы.
7. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (диско-диффузионный метод, метод серийных разведений, экспресс-методы).
8. Методы определения концентрации антибиотика в биологических жидкостях (сыворотка крови, моча).
9. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, механизмы формирования устойчивости и пути преодоления. Примеры.
10. Принципы рациональной антибиотикотерапии. Недостатки, осложнения и неудачи антибиотикотерапии.
Практическая работа
З а д а н и е №1
Определить наличие микробного антагонизма между протеем (Proteus vulgaris) и антракоидом (B. anthracoides) по характеру роста протея на питательной среде. В середине чашки Петри с МПА сделан посев петлей протея, после чего полукругом вокруг посева была засеяна культура антракоида (посев по Перетцу), чашки инкубировали в термостате в течение 24 ч при 37°С.
Учитывая культуральные особенности протея учесть результат опыта (зарисовать в альбом) и объяснить механизм микробного антагонизма.
З а д а н и е №2
Определить действие фитонцидов чеснока на разные микроорганизмы (Sarcina ventriculi, E. coli, S. aureus). Сделан посев микроорганизмов перпендикулярными штрихами к вытяжке из чеснока. Учесть результат опыта (зарисовать в альбом). Ответить на вопросы: 1. Каков механизм действия фитонцидов? 2. Почему препараты из фитонцидов не нашли широкого применения в медицине? |
|
З а д а н и е №3
В детском терапевтическом отделении среди группы детей от 6 месяцев до 1 года, госпитализированных по поводу пневмонии, возникла вспышка острого кишечного заболевания. Лабораторная диагностика показала, что у всех детей заболевание вызвано кишечной палочкой. Для проведения эпидемиологического анализа необходимо определить колициночувствительность выделенных штаммов кишечных палочек. Используя готовые демонстрационные посевы определить колицинотипы изучаемых культур, обозначив буквами (соответственно типам колицинов, выделяемых набором колициногенных штаммов). Оформить протокол в виде рисунка. Сделать вывод о возможном источнике инфекции.
Обследуемые |
Рисунок |
Колицинотип |
Ребенок А. |
|
|
Сотрудник В. |
|
|
Сотрудник С. |
|
|
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Колициногенные музейные культуры, выделяющие разные типы колицинов, засевают уколом в чашку Петри, разделенную на маленькие квадратики, после проращивания посевы убивают парами хлороформа. Сверху сплошным газоном засевают исследуемые штаммы бактерий, выделенные от больных и носителей (каждый на отдельной чашке).
Учет результатов проводится после суточной инкубации в термостате. При наличии колициночувствительности вокруг колициногенного штамма отмечается стерильная зона.
З а д а н и е №4
В клинику поступили больной А., 27 лет с диагнозом стафилококковой пневмонии и больной Б., 1 лет, с диагнозом колиэнтерит. Для успешного этиологического лечения при выборе эффективного антибиотика было рекомендовано определение антибиотикограммы возбудителей. Используя готовые демонстрационные посевы учесть результаты определения чувствительности микробов к антибиотикам диско-диффузионным методом, составить антибиотикограмму. Оформить протокол. Сделать заключение по каждому возбудителю, заполнить бланк-ответ.
Вид возбудителя |
Рисунок |
Величина зон задержки роста, мм (S, R, I)* |
|||||
Антибиотики |
|||||||
S. aureus |
|
|
|
|
|
|
|
|
Антибиотики |
||||||
E. coli |
|
|
|
|
|
|
|
S – чувствительные, R – резистентные (устойчивые), I – умеренно чувствительные
Форма № 239/у
Утв. МЗ СССР 04.10.80 № 1030