Практическая работа

З а д а н и е №1

Выделена чистая культура бактерий, которая по морфологическим, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам идентифицирована как дизентерийная палочка Флекснера. С помощью монорецепторных сывороток определить серовар выделенной культуры. Оформить протокол исследования. Сделать заключение. Ответить на вопросы:

1. Какой метод исследования применен?

2. С какой целью поставлен контроль?

3. Зачем нужно определять серовар возбудителя?

Результат	Ингредиенты реакции
	Сыворотка Флекснера тип 1 + чистая культура бактерий	Сыворотка Флекснера тип 2 + чистая культура бактерий	Физиологический раствор + чистая культура бактерий
	Рисунок	Рисунок	Рисунок

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

На обезжиренное предметное стекло наносится петлей капля иммунной сыворотки. В каплю сыворотки вносят петлей культуру бактерий и перемешивают до легкого помутнения. Стекло слегка покачивают. При положительном результате через 2-5 мин видны мелкие зерна, а позднее – крупные хлопья, смещающиеся на край капли, а жидкость становится прозрачной. В контроль вместо сыворотки вносят физиологический раствор.

З а д а н и е №2

Учесть результаты реакции агглютинации, поставленную с целью определения титра антител в сыворотке больного с клиническим диагнозом «Бруцеллез?». Для этого готовят ряд последовательных разведений сыворотки физиологическим раствором, к которым добавляют бруцеллезный диагностикум. Результаты внести в таблицу. Зарисовать механизм реакции. Сделать заключение. Ответить на вопросы:

1. Какой метод диагностики применен?

2. Что такое титр антител?

3. Зачем поставлены контроли сыворотки и антигена?

Ингредиенты	Разведения сыворотки					КАg	Ксыв.
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160
Физиологический раствор, мл	1 1	1 1	1 1 1	1 1	1	1	-
Сыворотка обследуемого 1:5, мл	1	--	--	--	--	-	1 (1:5)
Бруцеллезный диагностикум, капли	2	2	2	2	2 1	2	-
Результат (+/-)

Д

в дез. раствор

створ

иагностический титр 1:200, «+» – агглютинация, «–» – отсутствие агглютинации

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Реакцию учитывают невооруженным глазом до встряхивания пробирок, а затем при их легком встряхивании пальцем правой руки. В сомнительных случаях используют агглютиноскоп или лупу. Опытные пробирки сравниваются с контролями:

К_Аg – равномерное помутнение, исключается спонтанная агглютинация антигена. К_сыв. – содержимое прозрачное, отсутствие спонтанной агглютинации антител. При таких контролях результаты РА, положительные или отрицательные, будут достоверными.

Интенсивность реакции выражается плюсами:

++++ – реакция резко положительная; весь агглютинат на дне пробирки в виде зонтика, жидкость над ним прозрачная;

+++ – реакция положительная; осадок выражен, надосадочная жидкость слегка мутная;

++ – частичная агглютинация с небольшим осадком, надосадочная жидкость мутная;

+ – сомнительная агглютинация, жидкость мутная.

При отрицательной реакции – агглютинации нет, взвесь остается равномерно мутной и по виду неотличима от содержимого пробирки с контролем антигена. Титром РА считают максимальное разведение сыворотки с интенсивностью реакции не менее, чем ++.

Оценка результатов: для подтверждения или опровержения диагноза заболевания, полученный титр РА сопоставляют с диагностическим титром. Например: диагностический титр РА при брюшном тифе равен 1:100 у непривитых детей, 1:200 у непривитых взрослых.

З а д а н и е №3

Поставить, учесть и оценить результаты реакции термокольцепреципитации Асколи с преципитирующей сибиреязвенной сывороткой и термоэкстрактом из кожи овец. Объяснить механизм реакции. Оформить протокол (схема постановки, рисунок). Сделать заключение.

№ п/п	Ингредиенты	Опыт	Контроли
			антигена	сыворотки
1	Нормальная сыворотка кролика (1-я пипетка)	-	5 капель	-
2	Преципитирующая сыворотка (1-я пипетка)	5 капель	-	5 капель
3	Физиологический раствор хлорида натрия (2-я пипетка)	-	-	5 капель
4	Исследуемый термоэкстракт (2-я пипетка)	5 капель	5 капель	-

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Реакцию ставят в узких пробирках. Обязательным условием правильной постановки является медленное наслаивание по стенке пастеровской пипеткой физиологического раствора и исследуемого термоэкстракта, пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслоении четко видна граница между двумя слоями жидкости. Реакцию учитывают через 5 мин.

К_сыв. – не должно быть кольцепреципитации (отсутствие спонтанной преципитации сыворотки); К_Аg – не должно быть кольцепреципитации (отсутствие спонтанной преципитации антигена). При таких контролях полученные результаты РП будут достоверными.

В случае положительной реакции на границе между сывороткой и исследуемым термоэкстрактом появляется преципитат в виде кольца белого цвета, при отрицательной реакции – кольцо отсутствует. Положительная РП свидетельствует о наличии в исследуемом экстракте антигена соответствующего антителам преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, т. е. антигена возбудителя сибирской язвы; отрицательная РП свидетельствует об его отсутствии.

З а д а н и е №4

Учесть результаты реакции флоккуляции, поставленную с целью определения титра антитоксина по схеме:

Ингредиенты	1	2	3	4	5
Антитоксическая сыворотка, мл	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6
Анатоксин (20 МЕ/мл), мл	2	2	2	2	2
Результат

Отметить наличие инициальной флоккуляции и рассчитать титр антитоксина. Оформить протокол (схема постановки, рисунок). Сделать заключение.

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген и антитело содержаться в эквивалентных соотношениях.

«Инициальная» флоккуляция проявляется в той пробирке, где количество токсина соответствует количеству международных единиц сыворотки. Например, флоккуляция произошла в 3-й пробирке, значит, в 0,4 мл сыворотки находится 40 МЕ. Следовательно, 1 мл сыворотки содержит 40:0,4 = 100 МЕ.

З а д а н и е №5

Изучить механизм и овладеть методикой оценки результатов реакции диффузной преципитации в геле для определения токсигенности дифтерийной палочки (Corynebacterium diphtheriae). Результаты оформить в виде рисунка с обозначениями.

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

В чашку Петри с прозрачной питательной средой помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой. Исследуемые культуры засевают в виде бляшек по обе стороны от полоски фильтровальной бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру C. diphtheriae.

Чашки инкубируют при 37С в течение 24-48 ч. При диффузии в агаре в зоне эквивалентных концентраций антигена и антител образуются иммунные комплексы, хорошо видимые в проходящем свете в виде мутных полос – «усов» или дуг преципитации. Достоверность результатов подтверждается наличием дуг преципитации с заведомо токсигенной культурой.

Положительная реакция преципитации свидетельствует о токсигенности исследуемой культуры, отрицательная – об ее нетоксигенности.

З а д а н и е №6

Учесть результаты индикации и идентификации ботулинического токсина в пищевом продукте в реакции нейтрализации токсина антитоксином на мышах. Результаты представлены в таблице. Оформить протокол. Ответить на вопросы:

1. Какой метод диагностики применен?

2. Какая поставлена реакция?

3. Определить наличие и тип ботулинического токсина.

Ингредиенты/ мыши	1	2	3	4	5	6	7
1. Экстракт пищевого продукта	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
2. Смесь антитоксических противоботулинических сывороток	–	0,5	–	–	–	–	–
3. Сыворотка типа А	–	–	0,5	–	–	–	–
4. Сыворотка типа В	–	–	–	0,5	–	–	–
5. Сыворотка типа С	–	–	–	–	0,5	–	–
6. Сыворотка типа Е	–	–	–	–	–	0,5	–
7. Сыворотка типа Д	–	–	–	–	–	–	0,5
Результаты эксперимента на мышах	погиб.	жива	погиб.	жива	погиб.	погиб.	погиб.

З а д а н и е №7

Классифицировать набор предложенных иммунобиологических диагностических препаратов. Результаты представить в виде схемы.

Название (Н):

Классификационное положение (КП):

Действующее начало (ДН):

Получение (П):

Применение (Пр):

Способ применения (СП):

занятие №10

антитела. Реакции иммунитета

Реакции сложной агглютинации, связывания комплемента,

с применением меченых антител (РИФ, ИФА)

Вопросы для подготовки

1. Антитела. Классы иммуноглобулинов, строение и функции.

2. Методы количественного определения (радиальная иммунодиффузия по Манчини).

3. Динамика синтеза антител, механизм переключения синтеза антител одного класса на другой. Первичный и вторичный иммунный ответ.

4. Моноклональные антитела: определение, достоинства и получение.

5. Реакция Кумбса, ингредиенты, механизм, применение.

6. Реакция непрямой и обратной гемагглютинации (РНГА и РОНГА), ингредиенты, механизм, применение.

7. Реакция Ко-агглютинации и латекс-агглютинации, ингредиенты, механизм, применение.

8. Лизины, бактериолизины. Реакция связывания комплемента, ингредиенты, механизм, применение.

9. Реакция иммунофлюоресценции, ингредиенты, механизм, применение.

10. Иммуноферментный анализ, ингредиенты, механизм, применение.

11. Флюоресцирующие иммунные сыворотки, получение, применение.

12. Схематично зарисовать структуру IgG. Указать: Fab-, Fc-фрагменты; H-, L-цепи; домены; рецептор для комплемента; активный центр.