Практическая работа

З а д а н и е №1

Изучить адгезивные свойства микроорганизмов. Микроскопировать фиксированный препарат, приготовленный по Брилису с целью изучения адгезивных свойств Staphylococcus aureus. Определить средний показатель, индекс адгезии и коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе. Оформить протокол в виде рисунка, занести методику в альбом. Сделать заключение. Ответить на вопросы:

1. За счет чего происходит адгезия стафилококка на эритроцитах?

2. Почему использовали эритроциты человека I (0) группы крови?

3. На каком этапе инфекционного процесса работает данный фактор?

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

На предметное стекло наносят каплю буферного раствора (рН 7,2), в котором суспендируют взвесь изучаемого микроорганизма и отмытых стандартных формалинизированных эритроцитов человека I (0) группы крови. Препарат на 30 мин помещают во влажную камеру при 37°С, после чего высушивают при той же температуре, фиксируют метанолом, окрашивают метиленовым синим и микроскопируют.

Степень адгезивной активности оценивают с помощью среднего показателя адгезии (СПА), под которым понимается среднее число микроорганизмов, прикрепившихся к одному эритроциту. Адгезивность считается нулевой при СПА от 0 до 1,00, низкой – при СПА от 1,01 до 2,00, средней – от 2,01 до 4,00 и высокой при СПА свыше 4,00.

При оценке адгезивных свойств микроба также используют показатели СПА, К и ИАМ.

К (коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе) – процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы.

ИАМ (индекс адгезивности микроорганизма) – среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, вычислется по формуле:

Микроорганизм считается неадгезивным при ИАМ < 1,75, низкоадгезивным – от 1,76 до 2,5, среднеадгезивным – от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивным при ИАМ выше 4,0.

З а д а н и е №2

Изучить факторы вирулентности трех видов стафилококков. Оформить протокол. Сделать заключение. Ответить на вопросы:

1. Какой из исследованных стафилококков наиболее агрессивный? Почему?

2. На каких этапах инфекционного процесса работают данные факторы?

3. Какие инфекционные заболевания могут вызывать, исследуемые стафилококки? Почему?

Фактор вирулентности	Принцип выявления	Рисунок	Назначение фактора

Фактор Стафилококк	Гиалуронидаза	Плазмокоагулаза	Гемолизин	Лецитоветиллаза
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus

«+» – наличие фактора, «–» – отсутствие фактора

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Гиалуронидаза выявляется при посеве испытуемой культуры в пробирку с субстратом содержащим гиалуроновую кислоту. Посевы инкубируют в течение 15 мин при 37°С. Затем добавляют 2-3 капли концентрированной уксусной кислоты. В случае выработки фермента после добавления уксусной кислоты сгусток муцина не образуется, а в контроле при взаимодействии с уксусной кислотой муцин выпадает в осадок.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в стерильную цитратную плазму крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 2-5 ч. В случае выработки фермента происходит свертывание плазмы, а в контроле она остается жидкой.

Гемолизин определяют путем посева испытуемой культуры «бляшками» в чашки Петри с кровяным агаром. Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение суток. В положительном случае вокруг «бляшек» образуется зона гемолиза.

Лецитоветиллаза выявляется путем посева испытуемой культуры «бляшками» в чашки Петри с желточно-солевым агаром (содержит лецитин). Чашки инкубируют в термостате при 37°С в течение суток. В положительном случае вокруг «бляшек» образуется желто-оранжевый налет («радужный венчик»).

З а д а н и е №3

Изучить факторы персистенции трех штаммов золотистого стафилококка на примере антилизоцимной активности (АЛА). Оформить протокол в виде рисунка. Сделать заключение. Ответить на вопросы:

1. Почему в качестве субстрата для определения АЛА используют лизоцим?

2. С какой целью используют микрококк?

3. Каков механизм АЛА микроорганизмов?

4. Какой из исследованных штаммов обладает большим персистентным потенциалом? Почему?

5. На каких этапах инфекционного процесса работает данный фактор?

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

В плотную питательную среду добавляют определенное количество лизоцима, на поверхность засевают в виде бляшек исследуемые бактерии, а через сутки после обработки хлороформом наносят второй слой агара с микрококком (Micrococcus luteus). Учет результатов проводят по росту микрококка вокруг культур, инактивировавших лизоцим.

З а д а н и е №4

Изучить действие бактериальных эндотоксинов на макроорганизм. В течение всего занятия вести наблюдение за развитием симптомов эндотоксиновой интоксикации у белой беспородной мыши, которой внутрибрюшинно ввели 2 мл взвеси Proteus vulgaris в физиологическом растворе. Описать наблюдения в протоколе. Сделать вывод. Ответить на вопросы:

1. Какой метод исследования применен?

2. Каков механизм освобождения токсина?

3. Можно ли назвать данный инфекционный процесс инфекционной болезнью?

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Помощник держит животное вниз головой. В этом положении кишечник смещается в сторону диафрагмы, что в значительной мере уменьшает возможность его повреждения в момент прокола. Обрабатывают намеченное место прокола антисептиком и, преодолевая сопротивление, очень осторожно, буравящими движениями иглу продвигают вглубь. Чувство «провала», исчезновение ощущения сопротивления на пути говорят о проникновении иглы в брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и вводят 2 мл взвеси Proteus vulgaris в физиологическом растворе содержащийся в шприце в полость брюшины. Вторую мышь оставляют незараженной в качестве контроля.

З а д а н и е №5

Провести бактериологическое изучение трупа белой беспородной мыши, которую заразили отделяемым из раны больного хирургического отделения больницы. Оформить протокол бактериологического исследования по дням. Сделать вывод о форме инфекционного процесса (токсинемия или сепсис), составить примерную схему дальнейшего исследования (после 3-го дня).

1-й день исследования

Дата заражения	Вид животного	Материал для заражения	Микроскопия материала для заражения (рисунок)

2-й день исследования

Дата гибели животного	Дата вскрытия трупа животного	Результат микроскопии (рисунок)
		крови	печени	селезенки

3-й день исследования

Результаты посева (рисунки чашек Петри)
крови	печени	селезенки

М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я

Проводят заражение белой беспородной мыши (методику см. задание №4) исследуемым патологическим материалом. Зараженное животное помещают в клетку, на которой приклеивают этикетку с указанием даты, дозы заражения и использованного для заражения материала. После гибели животного производится вскрытие трупа в целях обнаружения возбудителя путем микроскопического исследования мазков-отпечатков из органов и выделения чистой культуры.

Для вскрытия животное помещают брюшком вверх на специальную доску, покрытую ватой, смоченной дезинфицирующим раствором и фиксируют за лапки металлическими булавками. Вскрытие трупа производят стерильными инструментами. Проводят отсепаровку кожи от подлежащей ткани, вскрывают грудную полость, делают посев крови из сердца на кровяной агар и готовят мазок на предметном стекле. Вскрывают брюшную полость, осматривают органы брюшной полости, проводят посев ткани печени и селезенки (при необходимости других органов и тканей) на кровяной агар и готовят мазки-отпечатки из этих органов на предметном стекле. Микропрепараты окрашивают по Граму. Посевы ставят в термостат и инкубируют сутки при 37°С.

занятие №8

Факторы неспецифической резистентности организма

Изучение фагоцитоза, гуморальных факторов,

барьерной функции кожи и слизистых

Вопросы для подготовки

1. Определение понятия «Иммунитет». Классификация видов и форм иммунитета, их общая характеристика

2. Неспецифические факторы защиты: стресс, лихорадочная реакция, арреактивность клеток и тканей, барьерная функция кожных покровов и слизистых, выделительная функция органов, нормальная микрофлора кожи и слизистых.

3. Клеточные факторы неспецифической резистентности. Стадии и механизм фагоцитоза. Фагоцитирующие клетки, их функциональные отличия. Завершенный и незавершенный фагоцитоз.

4. Клеточные факторы неспецифической резистентности: натуральные киллеры, строение, механизм контактного киллинга и системы включения апоптоза.

5. Воспаление как защитная реакция организма. Стадии развития воспалительного процесса (через Toll-like рецепторы).

6. Гуморальные факторы неспецифической защиты: система комплемента, его строение, функции, пути активации (классический, альтернативный и лектиновый путь).

7 Гуморальные факторы неспецифической защиты: лизоцим, дефензины, -лизины, трансферрин, лактоферрин, тромбоцитарный катионный белок, белки острой фазы, противовирусные ингибиторы, интерфероны (природа, механизмы и спектр действия).

8. Заполнить таблицу «Роль показателей естественной резистентности в антимикробной защите организма человека»:

Фактор	Роль в антимикробной защите	Факторы естественной резистентности (для внесения в незаполненный столбец таблицы)
	Секреция цитокинов, регулирующих клеточные и гуморальные механизмы защиты	Нейтрофилы Естественные киллеры (NK-клетки) Белки системы комплемента Белки острой фазы воспаления (БОФ) Лизоцим Дефенсины Макрофаги Дендритные клетки Тромбоцитарный катионный белок (ТКБ)
	Фагоцитоз внеклеточных патогенов
	Лизис клеточной стенки преимущественно грам+ бактерий
	Опсонины (факторы, усиливающие фагоцитоз)
	Уничтожение клеток, инфицированных микроорганизмами, опухолевых клеток
	Лизис преимущественно грам- бактерий и усиление цитолиза инфицированных, опухолевых клеток
	Универсальные антимикробным факторы (широкий спектр антимикробного действия)

9. Заполнить таблицу «Неспецифическое распознавание патогенов»:

PAMP*	PRR*	PAMP	PRR
Пептидогликан		Порины, белки клеточной стенки, белки ресничек
Тейхоевые и липотейхоевые кислоты
Несиалированные полисахариды		Белки вирусных капсидов
Липополисахариды		Гликопротеины суперкапсидов
Липоарабиноманнаны, миколовые кислоты		Неметилированные СрG-ДНК
Флаггеллин		Двунитевые РНК

*Патоген-Ассоциированные Молекулярные Паттерны (PAMP) и Патоген-Распознающие Рецепторы (PRR)

10. Решить задачу:

Обследуемый А., 18 лет, с 7 лет находящийся на диспансерном учете в группе ЧДБ (часто длительно болеющие), был направлен в клинико-иммунологическую лабораторию для оценки состояния факторов естественной резистентности (обследование проведено в весеннее время). Сравнить полученные результаты лабораторного исследования сыворотки крови и сделать заключение о состоянии естественной резистентности обследуемого (с объяснением).

ФИО обследуемого	Бактерицидная активность сыворотки (БАС)			Лизоцим, мкг/мл	Комплемент, мг/мл
	Кол-во колоний в контрольной чашке	Кол-во колоний в опытной чашке	БАС, %
Нормативные значения (пол мужской, 18 лет, весна)*	–	–	80,6	6,8	1,23
Обследуемый А.	10	3	?	5,0	0,81

* – нормативные значения показателей естественного иммунитета для населения ХМАО-Югры