2. Вопросы и задания для самоподготовки

1. Этапы построений идентификационных схем прокариот.

2. В чем заключается принцип деления царства прокариот на высшие таксоны.

3. Назовите основные отделы прокариот.

4. К какой группе принадлежат актиномицеты.

5. На основании какого признака архебактерии выделены в самостоятельную группу?

6. Принцип выращивания микроорганизмов в высоком слое питательной среды

7. Техника культивирования анаэробов в толще агаризованной среды.

8. Условия культивирования анаэробов в анаэростатах.

9. Химический способ создания анаэробных условий в среде.

10. Создание условий анаэробиоза с использованием биологического метода.

11. Среды и условия культивирования сульфатредуцирующих бактерий.

3. Оборудование и материалы

1. Микроскоп биологический МБР-3 или аналогичный

2. Спиртовка.

3. Термостат.

4. Питательные среды: Ван-Дельдена и/или Постгейта В.

5. Активный ил из аэротенка.

6. Материалы (покровные и предметные стекла для микропрепаратов; пипетки, вместимостью 5,0 мл с делениями, колбы или флаконы на 500 мл с ватно-марлевыми пробками, стерильные пробирки с резиновыми пробками 1%-ный водный раствор генцианвиолета или кристаллвиолета, раствор Люголя, склянка с 95%-ным этанолом, 0,1%-ный раствор фуксина).

4. Общие сведения

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБОВ

Выращивание анаэробных микроорганизмов более сложно, чем культивирование аэробов, так как соприкосновение культур анаэробов с кислородом воздуха должно быть сведено к минимуму или даже полностью исключено. Для этого используются различные приемы, нередко комбинируя их друг с другом. Создание условий анаэробиоза достигается различными методами.

1. Механический метод.

2. Физический метод.

3. Химический метод.

4. Биологический метод.

1. Механический метод.

Наиболее доступным и широко применяемым методом для защити посевов от кислорода воздуха является механический метод. При этом анаэробные условия создаются различными приемами.

1.1. Выращивание микроорганизмов в высоком слое жидкой среды

Жидкую среду наливают в сосуд для культивирования высоким слоем. Так как нельзя стерилизовать среды, если они занимают более половины высоты сосуда, часть среды стерилизуют отдельно и после посева ею заполняют сосуд для культивирования.

В некоторых случаях (при культивировании в пробирках) на дно стерильной пробирки вносят посевной материал, затем пробирку заполняют стерильной средой.

Если культивируемые микроорганизмы не образуют газы, то после заполнения сосудов питательной средой ватные пробки заменяют стерильными резиновыми или притертыми пробками.

1.2. Использование вазелинового масла (парафина).

Для выращивания микроорганизмов используют обычные пробирки, куда жидкие среды вносят в количестве 10-12 шт, агаризованные 5-6 мл. После посева поверхность среды заливают слоем (5-7 мм) стерильного вазелинового масла или стерильного расплавленного парафина, или их смесью (1:1, 1:3). Посев в агаризованную среду производят уколом. Вазелиновое масло, парафин стерилизуют дробно (2-3 раза) при 1 атм.

1.3. Загущение сред.

Уменьшение диффузии кислорода в глубь среды может быть достигнуто загущением сред агар-агаром, добавленным в количестве 0,2-0,3 %. Вязкие среды, как, например, кукурузный и картофельный заторы, могут использоваться для культивирования некоторых анаэробов без добавления специальных загустителей.

1.4. Выращивание в толще агаризованной среды

Этот прием используют для получения изолированных колоний при выделении чистых культур или определении численности анаэробных микроорганизмов.

Осуществляют глубинный посев. Для этого посевной материал вносят в расплавленную и остуженную до 48-50° С агаризованную, осветленную среду, тщательно перемешивают и переносят в заранее простерилизованные сосуды для культивирования: трубки Бурри, трубки Виньяль-Вейона, чашки Петри.

Трубки Бурри - это стеклянные трубки длиной 20-25 см, диаметром 1,0-1,5 см. При стерилизации оба конца закрывают ватными пробками. Перед посевом ватную пробку у одного конца заменяют стерильной резиновой через другой конец трубки вносят среду с посевным материалом и закрывают этот конец также резиновой пробкой.

Трубка Веньяль-Вейона представляет собой стеклянную трубку, один конец которой оттянут в виде пастеровской пипетки и запаян, ближе к другому концу (отступя от конца 1,0-1,5 см) имеется перетяжка. Длина трубки 25-30 см, диаметр 0,5-0,6 см. При стерилизации в незапаянный конец до перетяжки вставляется вата.

Засеянная агаризованная среда в трубку Веньяль-Вейона втягивается при помощи груши через оттянутый конец, затем этот конец (пастеровская пипетка) запаивается. По возможности нужно запаивать и другой конец на месте перетяжки или впитать в вату расплавленный парафин.

Трубку Виньяль-Вейона может заменить пипетка, Мора на 1 мл из тонкого стекла.

При использовании чашек Петри засеянную агаризованную среду наливают в крышку и сразу же на поверхность среды ставят дно чашки. Щель между краями два и крышки, где среда соприкасается с воздухом, заливают стерильным парафином (метод Штурм).

Вместо дна чашки можно использовать круглые стеклянные пластинки. Заранее перед стерилизацией на небольших подставках в чашки Петри помещают стеклянную пластинку (подставкой служат корковые пробки диаметром 0,5-0,6 см, высотой 0,2-0,3 см). После посева питательная среда плотно закрывается стеклянной пластинкой.

2. Физический метод.

Наиболее удобным приемом является выращивание посевов в анаэростате - вакуумной металлической камере, снабженной манометром.

Выращивание в анаэростатах имеет преимущество в том, что оно позволяет использовать стандартные бактериологические методы, включая посев культуры в виде газона, перенос колоний с помощью реплик, определение чувствительности к антибиотикам, поверхностный посев на скошеную агаризованную среду и т.п.

Анаэростатом может служить также обычный вакуумный стеклянный эксикатор, крышка которого снабжена двухходовым краном для откачивания воздуха. При использовании эксикатора края крышки предварительно смазываются специальной смазкой (2 части вазелина и 1 часть парафина). Из анаэростата или эксикатора откачивают воздух, а затем, как правило, заполняет их газовой смесью, состоящей из азота или аргона (90-80 %) и углекислоты (10-20 %) до давления порядка 67:10³ Па (500 мм рт.ст.). Развитие микроорганизмов требует парциальное давление газа. В безвоздушном пространстве происходит разрыв оболочек клеток за счет внутреннего тургорного давления. Для заполнения анаэростатов газовой смесью пользуются газометрами.

При постановке ряда опытов используются сосуды емкостью 3-5 литров. Через сосуд предварительно пропускается аргон для вытеснения воздуха. Затем в сосуд в токе аргона вносится питательная среда. До посева вновь через среду неоднократно продувают аргон.

3. Химический метод.

3.1. Удаление кислорода воздуха вне среды

Часто в лабораторной практике для удаления О₂ из окружающей среды используют вещества, поглощающие кислород. В этом случае посевы можно помещать в обычный эксикатор, на дно которого вносят вещества, поглощающие О₂, а на специальную подставку устанавливаются пробирки с бактериальной культурой, закрытые ватной пробкой. Воздух в этом случае из эксикатора не откачивается.

В качестве поглотителя используют щелочной раствор пирагаллола, дитионита натрия (Na₂S₂O₄) металлическое железо (стружки), тертый картофель и др. вещества или материалы. Необходимо при этом учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращивается культура. Например, на каждые 100 мл емкости используют 1 г пирогаллола и 100 мл 2,5 н раствора гидроксида натрия или смесь 20 % раствора пирогаллола и 20 % раствора Na₂S₂O₄ в соотношении 1:1, 50 г натертого картофеля.

Поглощение кислорода химическими веществами контролируют, используя раствор, содержащий окислительно-восстановительный индикатор. Для приготовления раствора смешивают равные объемы 0,024 %-ого раствора NaОН, 0,015 %-ого водного раствора метиленового синего и 6 %-ого раствора глюкозы. Перед употреблением в пробирку наливают 5 мл смеси и нагревают в кипящей водяной бане до обесцвечивания, быстро охлаждают и помещают в анаэростат. В анаэробных условиях раствор остается бесцветным.

Одним из современных физических методов является метод «вращающихся пробирок», в которых расплавленный агар распределяется тонким слоем по стенкам. Пробирку после посева заполняют газовой смесью, не содержащей О₂, и затем закрывают резиновой пробкой. Вращающиеся пробирки можно засевать штрихом с помощью специальной петли или шпателя, начиная со дна пробирки и затем постепенно продвигая петлю вверх, одновременно вращая пробирку и продувая её газом. Такой метод требует специальное оборудование.

3.2. Химический способ создания анаэробных условий в среде

Установлено, что для развития анаэробов наиболее благоприятен низкий окислительно-восстановительный потенциал среды, зависящий от накопления в ней «восстановителей», т.е. веществ, имеющих лабильный водород, легко восстанавливающий молекулярный кислород. Таким образом, величина окислительно-восстановительного (О-В) или редокс потенциала (Eh) является показателем степени анаэробиоза среды. Eh- это мера способности раствора отдавать или принимать электроны, т.е. окисляться или восстанавливаться, выражает в единицах разности электрического потенциала, т.е. в вольтах: чем более положительна эта величина, тем выше концентрация окисления по отношению к восстановителю в растворе, и наоборот. При высоких положительных значениях Eh, обусловленных присутствием растворенного О₂, подавляется рост всех анаэробных бактерий. В стандартной среде рост большинства анаэробных бактерий подавляется величине Eh выше 100 мВ. Химический способ создания анаэробных условий в среде основан на снижении величины за счет поглощения химическими веществами. Для этой цели используют способ внесения в среды различных восстановителей (редуктонов). Из них наиболее употребительны цистеин, дитиотрейтол, тиогликолат натрия, аскорбиновая кислота, сульфид натрия, амморфный сульфид железа.

Обычно готовят 1%-ые растворы этих восстановителей в 5 %-ом растворе бикарбоната натрия, дробно стерилизуют автоклавированием и добавляют к средам сульфид натрия из расчета 250-500 мг, а тиогликолат натрия от 250 мг до 1 г на 1 л среды. Восстановители использует в концентрациях, не влияющих на рост микроорганизмов.

Функции восстановителей выполняют и такие компоненты среды, как глюкоза и другие восстанавливающие сахара, таксе пептон. Можно с целью снижения с Eh к средам для культивирования анаэробов добавлять убитые клетки дрожжей, кусочки паренхиматозных органов животных (почки, печень, сердце) идя растительные ткани (клубни картофеля, корнеплоды).

В настоящее время, по-видимому, очень широкое применение найдет в качестве восстановителя сульфид железа.

Показано, что добавление всего 11 мкг/мл этого восстановителя обеспечивает удаление кислорода и снижение Eh.

Eh измеряют электрометрически на потенциометре или с помощью индикаторов, таких как резазурин, феносафранин и нейтральный красный, изменяющих окраску при изменении Eh.

Чаще в опытах используют резазурин, который добавляют к средам в концентрации 0,0001 % и стерилизуют вместе с минеральными компонентами среды. В окисленной форме он окрашен в слабо-розовый цвет, восстановленная форма бесцветна. Использование индикаторных красок имеет и другую полезную сторону. Так, нейтральрот позволяет на плотных питательных средах различать колонии облигатных и факультативных анаэробов.

На средах с нейтральным красным колонии облигатных анаэробов обнаруживаются по способности флюоресцировать и изменять окраску среда вокруг колоний в желтый цвет, в то же время среда вокруг колоний факультативных анаэробов не изменяет своего первоначального красного цвета.

4. Биологический метод.

Питательный агар наливает в чашку Петри и в её крышку или можно разрезать агар, налитый в чашку Петри, по диагонали узкой щелью. На одной из половинок или на поверхность агара в крышке засевают культуру аэробного микроорганизма, поглощающего кислород (кишечную палочку, чудесную палочку ), а на другую половину чашки или на поверхность агара в чашке высевают исследуемый материал. Чашку закрывают и заклеивают парафином или пластилином. Аэробные бактерии быстро используют кислород в герметически закрытой чашке, затем начинают размножаться анаэробы. Через 24-48 ч чашку открывают и из отдельных колоний выделяют чистую культуру анаэробов.

Для длительного хранения чистых культур спорообразующих анаэробов совместно высевают их с неспоровыми аэробами в жидкую среду в широкие высокие пробирки, закрытые ватными пробками. Среда занимает примерно 1/2 пробирки. При необходимости работы с анаэробным микроорганизмом культуральную жидкость пастеризуют, чем вызывают гибель аэробного вида.

Техника работы с анаэробами

1. Непосредственно перед употреблением жидкие среды кипятят для освобождения от растворенного кислорода в течение 25-30 минут, затем быстро охлаждают до 37-40°.

2. К средам обязательно добавляют восстановители: глюкозу, цистеин, сульфид натрия, тиогликолат натрия.

3. Успешному выращиванию облигатных анаэробов способствует внесение в среду большого количества посевного материала. Это объясняется тем, что при развитии анаэробов в культуральной жидкости накапливаются восстановители, которые связывают часть растворенного кислорода среды.

4. Для концентрации клеток в жидкой среде необходимо наличие твердой фазы - печень, мясо, вата, дробинки. В некоторых случаях добавляют вещества для связывания продуктов метаболизма (При культивировании молочнокислых, маслянокислых бактерий и особенно при хранении).

5. Газы азот, аргон, С0₂ или их смеси используют только после очистки от следов кислорода. Система для пропускания газов должна быть стерильной.

6. Необходимо выдерживать соответствующее время инкубации.

7. В тех случаях, когда анаэробы образуют большие количества газов (СО₂, Н₂, СН₄), необходимо обеспечить их удаление, чтобы не произошло взрыва. Для этого можно использовать затворы Мейсля.

Сульфатвосстанавливаюшие бактерии

Сульфатвосстанавливающими или сульфатредуцирующими называются бактерии, восстанавливающие сульфаты до сероводорода. Процесс, который они осуществляют носит название диссимиляционной сульфатредукции. Диссимиляционная сульфатредукция дает возможность бактериям окислять за счет связанного кислорода сульфатов разные субстраты в анаэробных условиях с получением анергии.

Все известные представители сульфатвосстанавливающих бактерий являются строгими анаэробами. Многие из них мезофилы, но есть и термофильные формы, оптимальная температура для которых 55-78°. Растут при рН от 4,2 до 10,4.

Сульфатредуцирующие бактерии распространены в анаэробных зонах многих пресных и соленых водоемов. Встречается также в почве, обычно в плохо аэрируемой и затопляемой (особенно в плохо обработанных рисовых полях). Как правило, сульфатвосстанавливающие бактерии встречается в компосте, термальных источниках, в испорченной пище, в пищеварительной тракте животных.

С деятельностью сульфатредуцирующих бактерий связано образование некоторых месторождений сульфидных минералов и отложение карбонатов. Наряду с активным участием в круговороте серы сульфатредуцирующие бактерии могут вызывать и весьма нежелательные явления, а именно гибель рыбы в некоторых водоемах в результате накопления сероводорода, отмирание растений на рисовых полях, загрязнение светильного газа. Кроме того, эти микроорганизмы способствуют коррозии металлического оборудования в шахтах, в нефтяных промыслах, а также подземных трубопроводов.

В настоящее время сульфатредуцирующие бактерии подразделяют на следующие 3 рода.

1. Desulfovibria - грамотрицательные бактерии - в виде вибрионов и спиралевидной формы с полярно расположенными жгутиками.

2. Desulfomaculum - грамположительные бактерии, палочковидные, подвижные, образующие споры.

3. Desulfomonas - палочковидные, бесспоровые, неподвижные бактерии.

Для выделения сульфатвосстанавливающих бактерий используются следующие среды:

Среда Ван-Дельдена (г/л)
Молочнокислый натрий	5,0
Аспарагин	1,0
МgSO4	1,0
К2НР04	1,0
Вода дистиллированная	1000,0
рН 7,0

После стерилизации вносят кристаллик железного купороса или 0,1-0,5 г лимонокислого железа.

Среда Постгейта В (г/л)

КН2Р04	0,5
NH4Cl	1,0
СаSO4 2H2O	1,0
МgSO4 2H2O	2,0
лактат натрия	3,5
дрожжевой экстракт	1,0
FeSO4 7H2O	0,5
Аскорбиновая кислота	1,0
Вода дистиллированная	1000,0

FeSO₄ 7H₂O добавляют в виде раствора в 1 % соляной кислоте.