Визначення антивірусної дії антибіотиків

Метод тканинних культур. Використовують культури тваринних клітин, які заражають відповідним видом вірусу. У середовище для вирощування культури додають випробовуваний антибіотик (культуральну рідину продуцента). За наявності антивірусної дії в середовищі, що оточує тканину, і в клітинах не буде виявлений вірус. При відсутності антивірусної дії віруси будуть активно розмножуватися в клітинах.

Метод з використанням листя рослин. Використовують для визначення активності щодо вірусу тютюнової мозаїки. Продуцент нарощують на агаровій платівці, вирізають блочки, які за допомогою розплавленого желатину прикріплюють до листя дурману, попередньо зараженого вірусом. Листя поміщають на кілька днів у вологі камери. Листя вкривається осередками некрозу. За наявності у антибіотика антивірусної дії навколо блочка осередків не буде. Для остаточної оцінки антивірусної дії використовують тварин.

Визначення протифагової активності антибіотика

Протифагові антибіотики застосовуються в основному в промисловості і в наукових дослідженнях. Мікроорганізм, що вивчається на протифагові властивості, висівають на агарове або в рідке середовище. Як тест-об'єкт використовують суміш бактерій і специфічного для цих бактерій фага. Якщо антибіотична речовина пригнічує ріст фага, то в зоні дифузії антибіотика (або в рідкому середовищі) спостерігається ріст тест-штаму бактерій. Якщо росту не спостерігається, то це може означати: 1) антибіотик не має протифагової активності; 2) антибіотик пригнічує ріст як фага, так і бактерії.

Останнє перевіряють, використовуючи як тест-організм тільки бактерію.

Визначення протиракової дії антибіотиків

Застосовують методи, що базуються на використанні культури тканин або пухлинних клітин, що вільно плавають в окремих порожнинах організму. Остаточно оцінюють на тваринах.

Чашковий метод. Тест-об'єктом служать клітини асцитного раку Ерліха (клітини знаходяться у вигляді суспензії в асцитичній рідині тварин). Завись клітин змішують з теплим агаровим середовищем і розливають у чашки Петрі (2×10⁷ клітин в 1 мл). На застиглу агарову платівку, яка містить клітини асцитного раку, накладають агарові блочки з продуцентом, що виріс, або диски, просочені його культуральною рідиною або розчином очищеного препарату. Чашки поміщають у холодильник на кілька годин для дифузії антибіотика в товщу агару, після чого інкубують у термостаті при 37 ˚С кілька годин, знімають блочки або диски з агару, поверхню заливають 0,05 % розчином метиленового синього. Чашки покривають скляними платівками і знову ставлять в термостат на декілька годин. За відсутності дії антибіотика на ракові клітини вся поверхня агарової платівки буде безбарвною. При наявності протиракової дії на місці блочків або дисків з'являться блакитні зони. Властивість знебарвлювати метиленовий синій пов'язана з виділенням живими асцитнми клітинами ферментів дегідраз. Убиті клітини дегідраз не виділяють.

Пробірочних метод. Модифікація чашкового методу. У пробірки вносять 0,5 мл випробовуваної культуральної рідини і 0,5 мл суспензії клітин асцитної раку (кінцева концентрація клітин 500 тис/мл), додають 2 мл розплавленого агарового середовища, що містить метиленовий синій. До контрольної пробірки замість випробовуваної культуральної рідини додають 0,5 мл середовища, на якому вирощують продуцент. Після перемішування пробірки поміщають у термостат при 37 ˚С на 3-4 год. Якщо вміст пробірок забарвлюється метиленовим синім, значить, випробуваний препарат пригнічує ріст ракових клітин.

Використання мікроорганізмів. Обмін речовин в пухлинних клітинах відрізняється від нормальних. Зокрема, інтенсивність дихання у них значно знижена. Виходячи з цього, як тест-об'єкти для пошуку протиракових антибіотиків замість пухлинних клітин використовують мутанти мікроорганізмів зі зниженим коефіцієнтом дихання.

Використання культур пухлинних клітин. Клітини деяких пухлин добре ростуть у рідких середовищах. Для культивування використовуються спеціальні судини – матраци Ру, де клітини ростуть у вигляді моношару. Після доброго розвитку моношару клітини знімають з поверхні матраца за допомогою детергентів, вносять в певній кількості в пробірки, змішуючи з рівним об'ємом культуральної рідини продуцента. Через 48 годин за допомогою камери Горяєва оцінюють розмноження клітин у контролі і в досліді.

Методи з використанням експериментальних тварин. Експериментальних тварин (зазвичай мишей) заражають сумішшю суспензії ракових клітин і культуральної рідини продуцента антибіотика шляхом підшкірної ін'єкції. Через 10 днів тварин забивають і визначають наявність пухлин і їх розміри. Якщо препарат має протиракову дію, то пухлини не розвиваються.

МЕТОДИ ІДЕНТИФІКАЦІЇ МІКРООРГАНІЗМІВ-ПРОДУЦЕНТІВ АНТИБІОТИЧНИХ РЕЧОВИН

Після виділення продуцента антибіотика необхідно визначити його приналежність до певного виду, встановити таксономічне положення. Для цього використовують стандартний спектр ознак: культуральні, морфологічні, фізіологічні, біохімічні, хімічний склад клітин, вміст ГЦ-пар в ДНК, ДНК-ДНК-гібридизацію і т.ін.

Крім того, використовують спеціальні методи.

Метод перехресного антагонізму. Найчастіше використовується для ідентифікації актиноміцетів. Метод ґрунтується на тому, що продуценти одного і того ж антибіотика, які виділені з різних джерел і належать до одного виду, не пригнічують розвиток один одного.

Суть методу: агарові блочки з виділеним продуцентом поміщають на поверхню агарової платівки, засіяної іншим (відомим) продуцентом. Як тест-культури використовують широкий набір штамів. При цьому виявляється, що один вид актиноміцета-антагоніста може пригнічувати ріст інших видів актиноміцетів і не пригнічує розвиток свого виду.

Використання організмів, стійких до певного антибіотика. В основу методу покладено дві головні ознаки, пов'язані з утворенням і дією антибіотиків: 1) Кожен антибіотик виробляється одним або декількома певними видами мікробів. 2) Мікроорганізми, стійкі до одного антибіотика, є стійкими і до антибіотичних речовин, близьких до нього за хімічною будовою і біологічними властивостями. Антибіотик, утворений невідомим мікроорганізмом, може бути визначений шляхом випробування його біологічної дії на ряд мікроорганізмів, чутливих і стійких до відомих антибіотиків. Таким шляхом можна з'ясувати подібність або відмінність біологічної дії, речовини, що вивчається, і відомих антибіотиків і тим самим вирішити питання про хімічну подібність або відмінність цих речовин. Суть методу: досліджуваний організм висівають на поверхню поживного агару у вигляді штриха чи окремої макроколоніі в центрі чашки Петрі. Антибіотик, що продукується, дифундує в агар і створює певну зону. Перетинаючи цю зону чутливими і стійкими до певного антибіотика мікроорганізмами, з'ясовують схожість біологічної дії, препарату, що вивчається, з відомими антибіотиками.

Метод хроматографії. Полягає в наступному: на смужки хроматографічнго паперу 20-30 см завдовжки і шириною 1 см наносять випробовуваний антибіотик. Підсушені на повітрі смужки з антибіотиком поміщають в ємність з відповідним розчинником на 10-20 год. Для виявлення антибіотиків на хроматограмі застосовують біологічні, хімічні і фізичні методи. Найбільш поширеним є біоавтографічний метод: висушені у витяжній шафі смужки паперу накладають на агарову платівку, попередньо засіяну культурою тест-організму. Чашки із смужками поміщають у термостат. За зонами відсутності росту, що утворюються навколо плями антибіотика на хроматограмі, судять про однорідність антибіотика і порівнюють отримані дані з відомими антибіотиками. Хімічні методи виявлення антибіотиків на хроматограмі базуються на реакціях, в результаті яких утворюються сполуки, що забарвлюють хроматограму або знебарвлюють барвник в місці знаходження антибіотика на хроматограмі.

Фізичні методи:

1. виявлення люмінесценції плями антибіотика при впливі УФ-випромінювання;

2. поглинання УФ-випромінювання;

3. визначення радіоактивної мітки антибіотика.

ОДИНИЦІ БІОЛОГІЧНОЇ АКТИВНОСТІ АНТИБІОТИКІВ Величина біологічної активності антибіотика зазвичай виражається в умовних одиницях, що містяться в 1 мл розчину (од/мл) або 1 мг препарату (од/мг).

За одиницю біологічної активності приймають мінімальну кількість антибіотика, здатну пригнітити розвиток або затримати ріст певного числа клітин стандартного штаму тест-мікроорганізму в одиниці об'єму живильного середовища.

МЕТОДИ КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ АНТИБІОТИКІВ Використовують біологічні, хімічні, фізико-хімічні та імунохімічних методи.

БІОЛОГІЧНІ МЕТОДИ

Ґрунтуються на безпосередній дії антибіотика на тест-організм і тому вважаються найбільш об'єктивними.

Метод послідовних розведень. Використовується для визначення кількості антибіотика в культуральних рідинах, розчинах або в екстрактах, для виявлення антибіотика при виділенні нових продуцентів. Для роботи готують поживний бульйон, придатний для розвитку обраного тест-мікроорганізму. Бульйон обов'язково повинен бути прозорим. Одночасно готують культуру тест-організму. Стерильний бульйон розливають у пробірки. Кількість бульйону має забезпечувати потрібний ступінь розведення досліджуваного антибіотика. Якщо антибіотик має високу біологічну активність і у випробовуваному розчині міститься у великій кількості, необхідно підготувати ряд пробірок з бульйоном таким чином, щоб забезпечити відносно велике розведення. У кожну пробірку отриманого ряду розведень вносять певне число клітин тест-мікроорганізму. Пробірки поміщають у термостат на 20-24 год при температурі, сприятливій для тест-об'єкту і визначають наявність або відсутність росту за помутнінням бульйону.

Приклад: ріст організму починається при розведенні 1:1100 і далі, в усіх попередніх пробірках, включаючи 1:1000 відсутній. Значить, у досліджуваному розчині міститься 1000 одиниць розведення антибіотика. Цим методом можна також визначити кількість антибіотика в стандартних одиницях активності або у вагових одиницях. Для цього паралельно з розведенням культуральної рідини роблять розведення стандартного розчину цього ж антибіотика (якщо досліджуваний антибіотик відомий). Повторюють всі описані вище операції, порівнюють розведення, в яких відсутній ріст і таким чином визначають кількість антибіотика. Приклад, ріст відсутній в культуральної рідини в розведенні 1:1024 і в розведенні стандартного розчину 1:32. Відомо, що початкова концентрація антибіотика в стандарті становила 10 мкг/мл.

Кількість антибіотика в культуральної рідини розраховують за формулою:

Х = Р_і: Р_с×С,

де Р_і – максимальний ступінь розведення випробовуваного розчину, за якого відсутній ріст тест-мікроорганізму,

Р_с – максимальний ступінь розведення стандартного розчину, що затримує ріст тест-мікроорганізму,

С – початкова концентрація стандартного розчину антибіотика,

Х – шукана концентрація антибіотика в досліджуваному розчині.

У нашому прикладі:

Р_і = 1024, Р_с = 32, С = 10 мкг/мл.

Шукана концентрація антибіотика: Х = 1024:32×10 = 320 мкг / мл.