Визначення антибіотичної активності мікроорганізмів

Після виділення передбачуваного продуцента з субстрату необхідно визначити його антибіотичну активність по відношенню до різних тест-об'єктів. Антибіотичні властивості мікроорганізмів вивчають при культивуванні їх на щільних (агаризованих) або в рідких середовищах.

МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИБІОТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ НА ЩІЛЬНИХ СЕРЕДОВИЩАХ

Метод перпендикулярних штрихів. Випробовуваний штам висівається широким штрихом на поверхню агарової платівки в чашці Петрі. Після того, як мікроорганізм добре розвинеться, перпендикулярно його штриху підсівають тест-організми. Чашки поміщають у термостат на 20-24 год. Якщо виділений мікроорганізм виявляє антимікробну дію, то чутливі до нього тест-мікроорганізми будуть рости на деякій відстані від штриха антагоніста.

Недолік методу: не завжди середовище в чашці підходить як для антагоніста, так і для тест-культур, або антагоніст і тест-штами розвиваються добре, але продукції антибіотика на цьому середовищі не відбувається.

Метод агарових блочків. Досліджуваний організм висівають суцільним «газоном» на поверхню агарової платівки в чашці Петрі. Використовують різні за складом середовища, це дає можливість одночасно визначити оптимальний склад середовища для розвитку продуцента і біосинтезу антибіотика. Після того, як продуцент добре розвинеться, стерильним пробковий свердлом (діаметр приблизно 8 мм) вирізують агарові блочки, які переносять на поверхню іншої агарової платівки, попередньо засіяної тест-мікроорганізмом. В одній чашці Петрі можна розмістити 5-7 блочків (це дає можливість досліджувати антагоністичні властивості відразу декількох продуцентів по відношенню до даного штаму). Чашки поміщають у термостат при температурі, сприятливій для розвитку продуцента. Якщо антибіотик, що виділяється продуцентом, пригнічує розвиток тест-мікроба, навколо агарових блочків утворюється зона відсутності росту.

Метод висіву антагоніста на одній половині агарової платівки з подальшим підсівом тест-мікробів штрихами на іншій половині платівки. Чашку Петрі ділять скляною перегородкою (предметним склом) навпіл. В одну половину наливають поживний агар, сприятливий для розвитку продуцента і утворення антибіотика, висівають суцільним газоном передбачуваний продуцент. Після доброго розвитку останнього вільну половину чашки заливають середовищем, сприятливим для тест-штамів, які висівають штрихами, перпендикулярними до межі розвитку антагоніста. Чашки знову поміщають у термостат при температурі, сприятливій для розвитку тест-мікроорганізмів. Через 20-24 проводять облік результатів: чутливі тест-штами будуть рости на певній відстані від антагоніста.

Варіант методу. Чашку заливають середовищем повністю, після чого стерильним скальпелем видаляють половину агарової платівки.

Метод агарового блочка, поміщеного в центр чашки Петрі. У чашку Петрі наливають середовище для розвитку продуцента з розрахунку 20-25 мл на стандартну чашку. У застиглому агарі стерильним пробковий свердлом (діаметром 20-22 мм) вирізують агарових блочки, які потім переносять в інші стерильні чашки Петрі. В центр кожного чашки розміщують по одному такому блочку, потім в ці ж чашки на вільну їх частину наливають середовище для тест-мікроорганізмів з розрахунком, щоб рівень цього середовища був на 1-1,5 см нижче рівня блочка. Досліджуваний продуцент висівають на поверхню блочки і поміщають у термостат до отримання його гарного росту. Потім по радіусах чашки висівають штрихами тест-організми і знову приміщують чашки в термостат. Відсутність росту тест-мікроба по штриху на будь-якій відстані від блоку вказує на пригнічення його антибіотичною речовиною продуцента, що вивчається.

Варіант методу. Агарові блочки з продуцентом вирізають із середовища, на якому уже виріс продуцент.

ВИЗНАЧЕННЯ АНТИБІОТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ МІКРООРГАНІЗМІВ, ЯКІ ВИРОСЛИ В РІДКИХ СЕРЕДОВИЩАХ

При визначенні антибіотичних властивостей мікроорганізмів, які виросли в рідких середовищах, слід враховувати, що деякі антибіотики накопичуються всередині клітин продуцента, не виділяючись в середовище. Тому антибіотичні властивості визначають у культуральній рідині і в екстрактах. Для екстракції антибіотика застосовують органічні розчинники (етиловий спирт, ацетон та ін.)

Використовують наступні методи:

Метод послідовних розведень (див. розділ «Методи кількісного визначення антибіотиків»)

Метод паперових-дисків. На агарову платівку в чашці Петрі висівають тест-організм. Диски з фільтрувального паперу діаметром 8 мм заготовляють заздалегідь, стерилізують в автоклаві. Стерильний диск беруть стерильним пінцетом, змочують у досліджуваній культуральної рідини, накладають на поверхню агару, засіяного тест-мікробом. Інкубують у термостаті. Про антибіотичну активність судять за зонами затримки росту навколо дисків.

Метод лунок та метод металевих циліндриків (див. розділ «Методи кількісного визначення антибіотиків»).