Етапи одержання антибіотиків

1. ВИДІЛЕННЯ ПРОДУЦЕНТІВ

2. ВИЗНАЧЕННЯ АНТИБІОТИЧНОЇ АКТИВНОСТІ ПРОДУЦЕНТІВ

3. КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ АНТИБІОТИКА

2. ІДЕНТИФІКАЦІЯ ПРОДУЦЕНТІВ

5. ВИДІЛЕННЯ І ОЧИЩЕННЯ АНТИБІОТИКА

6. ВИВЧЕННЯ ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ ПРЕПАРАТУ

7. ТЕСТУВАННЯ АНТИБІОТИКА НА СТЕРИЛЬНІСТЬ, ТОКСИЧНІСТЬ, ПІРОГЕННІСТЬ

8. ВИЗНАЧЕННЯ ШИРОКОГО АНТИМІКРОБНОГО СПЕКТРУ І ХАРАКТЕРУ АНТИМІКРОБНОЇ ДІЇ (БАКТЕРИЦИДНА, БАКТЕРІОСТАТИЧНА, БАКТЕРІОЛІТИЧНА)

9. ВИВЧЕННЯ ЛІКУВАЛЬНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ АНТИБІОТИКІВ

10. ВСЕБІЧНЕ ВИВЧЕННЯ ПОТРЕБ ПРОДУЦЕНТА І СКЛАДАННЯ ЛАБОРАТОРНОГО РЕГЛАМЕНТУ ДЛЯ ПРОМИСЛОВОГО ОДЕРЖАННЯ АНТИБІОТИКА

Виділення продуцентів антибіотиків. Загальні принципи

Продуцентів антибіотиків можна виділити з різноманітних субстратів: ґрунту, гниючих рослинних і тваринних залишків, мулів, води озер, річок, повітря та ін. Найбільше число виділяється з грунту.

Пошук продуцентів може переслідувати три можливих цілі:

1. Пошук продуцентів вже відомих, описаних і використовуваних антибіотиків.

2. Пошук нових антибіотиків, здатних виявляти біологічну дію по відношенню до конкретних організмів.

3. Виявлення продуцентів антибіотиків, що пригнічують певну мішень.

При пошуку відомих антибіотиків мають на увазі, що: 1) кожен антибіотик утворюється одним або декількома певними видами організмів;

2) кожен мікроорганізм продукує один або декілька конкретних антибіотиків.

Тобто досліджують тільки ті групи мікроорганізмів, для яких відома здатність до утворення даного антибіотика.

При пошуку нових антибіотиків досліджують всі виділені штами на здатність утворювати антибіотики.

Для досягнення третьої мети спочатку потрібно визначити мішень. Нею може бути конкретний фермент, відповідальний за найважливішу функцію метаболізму патогенного мікроорганізму.

В основу більшості прийомів виділення продуцентів покладено принцип отримання чистої культури мікроорганізму та безпосереднього випробування його по відношенню до тест-організмів. Істотне значення мають і змішані культури, тому що іноді при спільному вирощуванні двох мікроорганізмів можна отримати більш високий вихід антибіотика.

Важливе значення при виділенні продуцентів мають умови культивування. На вияв здатності мікроорганізмів до утворення антибіотиків впливають наступні фактори:

СКЛАД СЕРЕДОВИЩА – деякі мікроорганізми можуть добре розвиватися на певних середовищах, але при цьому не продукують антибіотик. Тому перевагу віддають середовищам, на яких спостерігається оптимальне співвідношення розвитку біомаси та продукції антибіотика. Особливий вплив на продукцію антибіотика має співвідношення джерел азоту та вуглецю, тому для конкретного продуцента підбирають індивідуальні умови. Крім того, необхідна певна кількість макро- і мікроелементів і, при необхідності, наявність факторів росту. Особливе значення має вміст в середовищі галогенів (хлор і бром безпосередньо беруть участь в утворенні деяких антибіотиків).

рН СЕРЕДОВИЩА – впливає на розвиток мікроорганізмів і характер їх обміну речовин. Бактерії-продуценти добре розвиваються при нейтральній та слаболужній реакції середовища, стрептоміцети – слабокислій, гриби – кислій.

ТЕМПЕРАТУРА – для більшості бактерій оптимальна температура росту 30-37 ˚С, стрептоміцетів – 26-30 ˚С, міцеліальних грибів – 25-28 ˚С.

АЕРАЦІЯ – більшість продуцентів антибіотиків – аероби, тому для їх оптимального розвитку необхідна аерація середовища. Аерування культур здійснюється 3-ма способами: 1) продуванням певного обсягу повітря через культуральну рідину з одночасним її перемішуванням або без нього; 2) струшуванням культуральної рідини, що знаходиться в колбах, на спеціальних апаратах (гойдалки, Шюттель-апарати); 3) вирощуванням мікроорганізмів у вигляді плівки на поверхні живильного середовища.

ОСНОВНІ МЕТОДИ ВИДІЛЕННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ-ПРОДУЦЕНТІВ АНТИБІОТИКІВ

Висів ґрунтової суспензії на поверхню агарової платівки. Певну наважку грунту, ретельно розтерту в ступці з невеликим об’ємом води, кількісно преносять в колбу зі стерильною водою. Вміст колби струшують протягом 5 хв, а потім з водної суспензії роблять ряд послідовних розведень, які висівають на відповідне агаризоване середовище, інкубують при потрібній температурі певний час і отримані окремі колонії пересівають в пробірки зі скошеним живильним агаром. Кожну виділену чисту культуру пересівають на різні за складом середовища і після доброго розвитку перевіряють її антибіотичні властивості.

Висів ґрунту на поживний агар, попередньо засіяний тест-організмом. Поверхню поживного агару засівають тест-культурою необхідного організму, після чого на агарову платівку розкладають невеликі (не більше просяного зерна) грудочки ґрунту або ґрунт наносять у вигляді пилу, розподіляючи його по всій поверхні платівки. Потім чашки поміщають у термостат і через 24-48 год (а іноді і більше) переглядають посіви і відзначають грудочки або окремі їх ділянки, навколо яких утворилися зони затримки росту тест-організму. З цих ділянок виділяють чисті культури продуцентів і вивчають їх.

Модифікація методу. На чашки Петрі з МПА, попередньо засіяні тест-організмом, бактеріологічною петлею наносять окремими краплинами завись грунту. На кожну чашку наносять 10-20 краплин, які, підсихаючи, залишають після себе ізольовані грудочки грунту. Через 1-2 доби перебування в термостаті при 26-35 ˚С грудочки обростають колоніями. Надалі вчиняють, як у попередній методиці.

Метод збагачення ґрунту. Ґрунт, з якого передбачають виділити антагоністи, збагачують організмами тих видів, по відношенню до яких хочуть отримати антагоніст. З цією метою до зразків ґрунту, поміщених у скляні судини, систематично додають відмиту суспензію потрібних мікроорганізмів. Через певні проміжки часу грунт висівають у вигляді окремих грудочок на агрові платівки в чашки Петрі, попередньо засіяні тим же самим організмом, який використовувався для збагачення ґрунту.

Метод центрифугування ґрунтової суспензії. Використовується для виділення стрептоміцетів з ґрунтів. Метод базується на розходженні швидкостей осідання окремих видів мікроорганізмів у центробіжному полі. При 3000 об/хв протягом 20 хв частки, відповідні за розмірами спорам цвілевих грибів або клітинам бактерій, осаджуються на дно пробірки. Частки, відповідні за розмірами спорам або окремим уривкам міцелію стрептоміцетів, опиняються в поверхневому шарі рідини. Висіваючи надосадову рідину, вдається отримати тільки колонії актиноміцетів.

Метод заморожування-відтавання ґрунту. Відомо, що в ґрунті мікроорганізми знаходяться в адсорбованому на частках стані. Для повноти десорбції мікроорганізмів з ґрунтових часток застосовують хімічні методи (обробка детергентами) і фізичні (механічне розтирання ґрунту). Можна використовувати метод заморожування-відтавання.

Суть методу: зразок ґрунту поміщають у морозильну камеру побутового холодильника (-8 ˚С), через годину виймають і витримують при кімнатній температурі до повного відтавання. Процедуру заморожування-відтавання повторюють двічі. Потім наважку грунту поміщають в стерильну водопровідну воду, збовтують 15 хв на круговій качалці (230 об/хв), після чого різні розведення суспензії висівають на поживний агар в чашки Петрі. Метод дозволяє виявити в 1,2-3,6 рази більше стрептоміцетів, ніж без обробки.

Обробка ґрунтового зразка карбонатом кальцію. Зразок ґрунту змішують з порошком карбонату кальцію у співвідношенні 10:1 і інкубують у вологомій камері при 28 ˚С. Вологість забезпечується шляхом укладання в чашки Петрі шматочків фільтрувального паперу, просочених дистильованою водою і прикріплених до кришки чашки. Метод дозволяє виділити приблизно на два порядки більше культур стрептоміцетів. Це збільшення, мабуть, пов'язане з тим, що іони кальцію ініціюють проростання спор стрептоміцетів.

Застосування поживних середовищ, що містять антибіотики. Для спрямованого виділення певних груп мікроорганізмів (таких, що рідко зустрічаються) в середовища для висіву ґрунтової суспензії додають різні антибіотики. При цьому звичайна мікробіота пригнічується і створюються умови для розвитку стійких до цих антибіотиків форм мікроорганізмів.

Обробка грунтової суспензії УФ-світлом. Метод базується на різній чутливості окремих видів актиноміцетів до УФ-світла. Використовується для виділення рідкісних видів актиноміцетів. Ґрунтову водну суспензію, розведену в залежності від зразка ґрунту у співвідношенні 1:10², 1:10³, 1:10⁴, в кількості 0,05 мл наносять на поверхню агарової платівки в чашці Петрі і опромінюють УФ-світлом з допомогою бактерицидної лампи БУВ-15. Опромінення проводять на відстані 20 см від джерела світла протягом 30 с-2 хв.

Використання хвиль надвисокої частоти. Метод використовується для виділення рідкісних видів актиноміцетів. Зразок ґрунту розтирають у ступці, просівають через сито і перемішують. 1 г грунту суспендують в 100 мл води, струшують протягом 10 хв і розводять 1:1000. У стерильні пробірки переносять по 2,5 мл суспензії і обробляють хвилями НВЧ. Для цього можна використовувати мікрохвильову піч марки «Pluton» з робочою частотою 2640 Мгц. Найкращий ефект спостерігається при режимі опромінення суспензії потужністю 80 Вт протягом 30 с. При цих параметрах спори актиноміцетів проявляють найбільшу стійкість. Опромінену суспензію розводять дистильованою водою у 10 разів і висівають на поверхню агарового середовища по 0,05 мл на чашку. Використовують середовища з антибіотиками і без них.