Лікувальні властивості антибіотиків
Наступний етап вивчення антибіотика – визначення його фармакологічних та терапевтичних властивостей. Лікувальні властивості перевіряють на лабораторних тваринах, заражених відповідною дозою певного виду патогенного мікроорганізму. Зазвичай використовують дози з таким розрахунком, щоб викликати загибель 50 % (LD50) або 100 % тварин (LD100).
Тварин розділяють на три групи. Одній групі антибіотик вводять відразу ж після зараження, другий – через 5 год або пізніше. У всіх випадках застосовують максимальні дози антибіотика, які переносяться тваринами. Третя група не піддається обробці антибіотиком і являє собою контроль. За кількістю особин, що вижили у дослідних групах, судять про терапевтичну цінність досліджуваного антибіотика. Надалі в експериментах визначають мінімальну терапевтичну дозу - мінімальна кількість антибіотика, що сприяє запобіганню загибелі тварини від смертельної дози інфекції.
Якщо терапевтична доза нижча за токсичну, то препарат може використовуватися в лікувальній практиці, якщо дорівнює або вище, то ні.
Після встановлення перспективності препарату необхідне всебічне вивчення властивостей продуцента з метою збільшення продукції антибіотика і подальшого отримання його в промислових масштабах. Для цього необхідно мати уявлення про кількість антибіотика, що виробляється продуцентом за одиницю часу (антибіотична продуктивність) і про особливості біосинтезу даного антибіотика.
Антибіотична продуктивність організму
Антибіотичною продуктивністю організму називають кількість антибіотика (у мкг або од), утворену 1 мг сухих клітин (або міцелію) досліджуваного організму за певний проміжок часу (1 год). Антибіотична продуктивність організму виражається в мкг/(мг×год) або од/(мг×год) і визначається за формулою:
Де Аt1 і At2 – кількість антибіотика, визначене до часу t1 і t2, мкг/л або од/мл; Мt1 і Мt2 – кількість біомаси, що утворилася в результаті розвитку організму до часу t1 і t2, мг;
t1 і t2 – час відбору проб, год.
Двофазний характер розвитку продуцентів антибіотиків
Біосинтез багатьох антибіотиків здійснюється мікроорганізмами на певному етапі їх розвитку. В умовах глибинного культивування (у великих обсягах рідких середовищ при перемішуванні) процес розвитку організму і біосинтезу антибіотиків проходить у дві фази.
1 фаза (тропофаза, або фаза збалансованого росту мікроорганізму) – спостерігається інтенсивне накопичення біомаси.
2 фаза (ідіофаза, або фаза незбалансованого росту мікроорганізму) - накопичення біомаси сповільнюється або її кількість зменшується, тому що основні компоненти середовища використані мікроорганізмом, а середовище збагачується продуктами життєдіяльності. Частина клітин починає лізуватися. Відбувається активне накопичення антибіотика в середовищі.
Шляхи підвищення антибіотичної продуктивності мікроорганізмів
Мікроорганізми-продуценти антибіотиків, виділені з природних субстратів, зазвичай мають низьку антибіотичну продуктивність. Для підвищення біосинтезу антибіотиків використовують три методи.
Метод природного мінливості мікроорганізмів Перш за все намагаються відібрати найбільш активні з виділених варіантів. Популяцію клітин висівають на агарову платівку в чашці Петрі з таким розрахунком, щоб на ній вийшло 40-50 ізольованих колоній. Потім колонії перевіряють на антибіотичну активність (двома способами).
1-й спосіб: колонії, які виросли, заливають розплавленим і охолодженим до 50-55 ˚С поживним агаром, що містить тест-організм, чутливий до даного антибіотика. Чашки поміщають у термостат на 20-24 год. Навколо колоній продуцента утворюються зони відсутності росту тест-організму. Про антибіотичну активність різних колоній судять за розмірами цих зон. Відбирають колонії, навколо яких діаметр зон найбільший.
2-й спосіб: готують чашки Петрі з поживним агаром, засіяним тест-організмом. У агаровій платівці пробковим свердлом роблять лунки діаметром 6-8 мм. Потім беруть чашку з вирослими колоніями продуцента і пробковим свердлом вирізують агарові блочки, що містять одну колонію. Діаметр блочка повинен дорівнювати діаметру лунок в чашці з тест-організмом. Блочки вставляють у лунки, чашки поміщають у термостат і через добу визначають діаметри зон затримки росту тест-організму навколо блочків з колоніями продуцента. Відбір активних штамів провадять аналогічно першому способу.
Індукований мутагенез і ступінчастий відбір. Метод ґрунтується на отриманні мутантних форм з вихідних штамів під впливом сильнодіючих факторів: фізичних (рентгенівське випромінювання, ультрафіолетове опромінення, нейтронне випромінювання); хімічних (азотиста форма іприту, етиленімін, амінопурін, нітрозогуанідин, гідроксиламін); біологічних (гени-мутатори, транспозони і т.ін.). Часто використовують поєднаний вплив на продуценти різних факторів. В результаті застосування цих методів вдалося підвищити вихід багатьох антибіотиків у 50-100 разів.
Застосування генно-інженерних маніпуляцій. Суть методу полягає у введенні окремих, штучно клонованих, генів у геном продуцента. Метод дозволяє підвищити біосинтез антибіотика на один-два порядки. Іноді таким шляхом можна «примусити» мікроорганізм синтезувати у великих кількостях антибіотик, який в нормі ним не виробляється.