28) Введення в рослинну клітину (без векторів)

Генетична гармата, або балістична трансформація: Маленькі золоті або вольфрамові частинки покриваються чужорідною ДНК і вистрілюються в молоді рослинні клітини або ембріони. Деякий генетичний матеріал залишиться в клітинах і трансформує їх. Цей метод також дозволяє трансформацію рослинних органел - пластид. Ефективність трансформації нижче, ніж при трансформації за допомогою Agrobacterium, але більшість рослин можуть бути трансформовані цим методом.

Електропорація: як і з бактеріями, отвори в клітинах рослин робляться, використовуючи електричний струм.

29) Вектори на основі віруса cb-4o

Вірус SV40 і вірус папіломи використовуються як вектори для клонування в клітинах тварин.Вірус SV40 виявлений в організмі макаки-резуса, викликає злоякісні пухлини в гризунів. ДНК вірусу вбудовується в ДНК ссавців. Розмір його ~5 т. н. п.

Вірус проникає в клітину, направляється до ядра, де відбувається його “роздягання” від капсида. Далі в строгій часовій послідовності починається його експресія. Транскрипція починається із сайта ori і йде в напрямку проти часової стрілки. Спочатку транскрибуються гени двох ранніх білків, малого й великого T-антигену, а потім пізні гени. Пізні гени транскрибуються за годинниковою стрілкою, cпочатку поблизу сайта ori. Далі відбувається зборка вірусу, і він вивільняється із клітини і клітина гине. Загальні принципи конструювання вектора SV40 аналогічні бактеріофагу λ:

• видалення певних ділянок вірусного геному за допомогою рестриктаз;

• Заміщення вірусної ДНК чуженородної ДНК.

Типи SV40-векторів:

1. трансдукуючі SV40-вектори - рекомбінанти SV40 і чужорідної ДНК. Їх вводять в клітини, які потім продукують нормальні вібріони;

2. плазмідні SV40-вектори - рекомбінанти, які здатні реплікуватися, але не запаковуватись;

3. пасивні трансформуючі вектори – рекомбінантні молекули, в які включені невеликі фрагменти SV40, які забезпечують експресію чужорідних генів. Вони не здатні не реплікуватись, не запаковуватись.

Для трансдукуючих SV40-векторів, щоб SV40-вектор упакувався з утворенням вірусних часток необхідно виконання 3-х умов:

1. вектор повинен уміщати сегмент розміром 300 н. п. із сайтом ori. Це необхідно для забезпечення синтезу вірусної ДНК і регуляторних послідовностей, відповідальних за синтез мРНК;

2. сумарна довжина рекомбінантної ДНК повинна бути не більше 5300 п. н., але не менше 3900 п. н., тобто вектор повинен мати певний розмір, необхідний для впаковування ДНК у вірусні частки;

3. повинні бути в наявності білки великого Т-антигену і 3 капсидних білки VP1, VP2, VP3, хоча їхнє кодування самим рекомбінантним геном не обов'язково.

Особливістю вірусу SV40 є те, що всі ділянки значимі, не значимих немає.

До інтактного геному SV40 уже практично неможливо додати який-небудь фрагмент ДНК, щоб не була порушена умова, при якій буде відбуватися його впакування. Тому, загальна стратегія полягає:

1. у делегуванні кодуючої області вектора, заміщенні її чужорідним фрагментом ДНК;

2) у забезпеченні синтезу продукту втраченого гена за допомогою аналогічного гена, що входить до складу або вірусу – помічника, або хазяїна.

SV40-плазмидні вектори вперше були сконструйовані в 1980-1982р. Бергом. Вони здатні реплікуватись як у тварин, так і у бактеріальних клітинах, але не можуть упаковуватись з утворенням вірусних часток. Плазмідні SV40-вектори можуть бути човниковими і існувати в клітинах E.coli та тварин, оскільки ніяких обмежень на розмір, необхідний для впакування не накладається.

Плазмідні SV40-вектори включають:

• ori-сайт і селективний маркер плазміди pBR322.

• ori-сайт та ранні гени вірусу SV40.

• ранній або пізній транскрипційний модуль вірусу SV40 рSV2, що може існувати тільки в cos-клітинах, а рSV3 немає.

• gpt ділянка, за допомогою якої можна ідентифікувати у тваринних клітинах вектори.

Недоліки: плазмідні SV40-вектори нестабільні.

Використовуються для дослідження експресії генів у тварин.

Пасивні вектори, що трансформуються, не здатні до самостійної реплікації, а лише доставляють певні сегменти ДНК, які вбудовуються в клітинну ДНК. Ці сегменти містять ділянки регуляції транскрипції і сайти поліаденілювання. Транскрибовані клітини реплікують чужорідні ДНК, як частину свого генома.