6.4.1. Обратимые ингибиторы

Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурент­ное, неконкурентное и бесконкурентное.

Конкурентным называют ингибитор, обратимо взаимодействующий с актив­ным центром фермента. Как правило, конкурентные ингибиторы по структуре похожи на субстрат и могут вытесняться из фермент-ингибиторного комплек­са избытком субстрата. Взаимодействие с конкурентным ингибитором не при­водит к денатурации или инактивации фермента, поэтому при замене ингиби­тора на субстрат скорость ферментативной реакции не снижается (рис. 6.10).

При взаимодействии фермента с конкурентным ингибитором изменяется значение К_м соответствующей ферментативной реакции.

Сходство субстрата и конкурентного ингибитора достаточно для взаимо­действия и образования фермент-ингибиторного комплекса, но недостаточно для ферментативной реакции. В качестве примера можно привести действие малоновой кислоты на реакцию, которая катализируется сукцинатдегидроге-назой и связана с превращением янтарной кислоты в фумаровую. Добавление малоновой кислоты к реак­ционной смеси снижает или полностью ос­танавливает ферментативную реакцию, так как она является конкурентным ингибито­ром сукцинатдегидрогеназы.

СООН —СН₂—СООН

малоновая кислота

Сходства малоновой кислоты с янтарной достаточно для образования комплекса с ферментом, однако распад этого комплекса не происходит. При увеличении концентра-ции янтарной кислоты она вытесняет малоновую кислоту из комплекса, в ре­зультате активность сукцинатдегидрогеназы восстанавливается.

Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и жи­вотных по конкурентному типу. Примером могут служить сульфамидные пре­параты, по структуре сходные с л-аминобензойной кислотой (ПАБК). Это со­единение в микробных клетках является интермедиантом фолиевой кисло­ты — важного компонента нуклеинового обмена. При введении сульфамидных препаратов в организм происходит ингибирование ферментов метаболизма ПАБК, что приводит к снижению синтеза нуклеиновых кислот и гибели мик­роорганизма. В данном случае сульфаниламид является конкурентным ингибитором фермента синтеза фолиевой кислоты.

В структуру пептогликана клеточной стенки бактерий включен о-аланин, отсутствующий в организме животных и человека. Для синтеза клеточной стенки бактерии при помощи фермента аланин-рацемазы превращают живот­ный [.-аланин в о-форму. Аланин-рацемаза характерна для бактерий и не об­наружена у млекопитающих. Следовательно, она представляет хорошую ми­шень для ингибирования лекарственными препаратами. Замещение одного из протонов метильной группы на фтор дает фтораланин, с которым связывается аланин-рацемаза, что приводит к ее ингибированию. Таким образом, можно конструировать лекарственные вещества, ингиби-рующие ферменты по конкурентному типу. Чтобы быть эффективным, инги­битор должен иметь высокое сродство к ферменту. В противном случае необ­ходимо назначать большие дозы лекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратом за активный центр фермента.

Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют с ферментами не в области активного центра, а на каком-то от него удалении, причем никаким избытком субстрата из комплекса не удаляются. При взаимодействии ингибитора с фер­ментом происходит изменение его конформации с последующей частичной дезинтеграцией активного центра. При взаимодействии фермента с неконку­рентным ингибитором изменяется К_тах ферментативной реакции.

Бесконкурентное ингибирование имеет место, когда ингибитор взаимо­действует с ферментом только в составе фермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду. Примером необратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганические вещества, применяемые в ка­честве инсектицидов.

Тип ингибирования можно определять графически, используя методы Лайнуивера—Бэрка или Эди—Хофсти (рис. 6.11).

Как видно из рис. 6.11, влияние конкурентного ингибитора на скорость реакции приводит к изменению К_м, максимальная скорость реакции при этом остается без изменения. Неконкурентное ингибирование связано со снижени­ем К_тах, без изменения константы Мехаэлиса.

Активность многих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколько механизмов этого процесса.

• Если в образовании фермент-субстратного комплекса участвует не­сколько функциональных групп фермента, то возможно одновременное при­соединение к активному центру двух или более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивного комплекса.

• В случае избытка субстрата возможно его присоединение не только к ак­тивному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативной реакции.

• Увеличение концентрации субстрата может повысить ионную силу реакци­онной среды и, как следствие, затормозить скорость ферментативной реакции.

Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связывать­ся с ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким обра­зом, что скорость прямой реакции снижается.

2. Организация дыхательной цепи транспорта электронов

Цепью переноса (транспорта) электронов или дыхательной цепью назы­вается совокупность последовательных окислительно-восстановительных ре­акций, в ходе которых при участии промежуточных переносчиков электронов происходит их перенос от исходного донора (восстановленный субстрат — 8Н₂) к терминальному акцептору электронов кислороду.

В клетках эукариот дыхательная цепь локализована во внутренней мембране митохондрий, а у прока -риот — в структурах цитоплазма™ -ческой мембраны.

Направление потока электро­нов при сопряжении одной окисли­тельно-восстановительной системы с другой определяется их стандарт­ными окислительно-восстановитель­ными потенциалами или редокс-по-тенциалами Е°. Обычно Е° системы сравнивают с потенциалом водорода, принимая последний за 0,0 В при рН 0. Однако для биологических сис­тем обычно используют значение стандартного окислительно-восста­новительного потенциала при рН 7.С¹ (Е°'). Стандартные окислительно-восстановительные потенциалы ком­понентов дыхательной цепи и суб­стратов приведены в Поскольку редокс-потенциалы определяют сродство вещества к электро­нам, то для любых двух пар система с более положительным значением Е" бу­дет самопроизвольно стремиться принимать электроны.

В настоящее время экспериментально определена последовательность расположения переносчиков электронов в дыхательной цепи (рис. 15.4). Сле­дует обратить внимание, что окислительно-восстановительный потенциал пе­реносчиков электронов в этой последовательности постепенно становится все более положительным. Структура и механизм обратимых окислительно-вос­становительных реакций превращения промежуточных переносчиков элект­ронов приведен выше.

В 60-х гг. XX в., благодаря методам мягкого разрушения интактных мито­хондрий, были выделены четыре дыхательных комплекса (I, II, III, IV), каж­дый из которых способен катализировать определенную часть полной после­довательности реакций дыхательной цепи:

• комплекс I (НАДН: КоО-оксидоредуктаза) катализирует перенос элект­ронов от НАДН к Кор;

• комплекс II (сукцинат: Ко(^-оксидоредуктаза)) — перенос электронов от сукцината к КоО;

• комплекс III (КорН₂: цитохром с-оксидоредуктаза) — перенос электро­нов от КорН₂ к цитохрому с;

• комплекс IV (цитохромоксидаза) катализирует перенос электронов от цитохрома с к кислороду.

Было установлено, что активность изолированных комплексов аддитивна, т. е. при смешении комплексов получается окислительно-восстановительная реакция, соответствующая сумме отдельных реакций дыхательной цепи. Вы­деление комплексов дыхательной цепи позволило сделать вывод об опреде­ленной пространственной ориентации этих комплексов в мембране. Важная роль в передаче электронов от одного комплекса к другому принадлежит КоО и цитохрому с. Цитохром с является единственным растворимым цитохромом и наряду с коэнзимом Р служит мобильным компонентом дыхательной цепи, осуществляя связь между фиксированными в мембране комплексами.

3.

№ 30.

1. Применение ингибиторов функций белков и ферментов, как лекарств, ядов и пестицидов. Комов475

2. Окисление водорода субстратов с образованием воды и трансмембранного электрохимического потенциала протонов. Роль адениловых нуклеотидов в окислительном фосфорилировании и дыхательном контроле.

3. Биосинтез заменимых аминокислот и превращение их безазотистых остатков в углеводы и липиды. Комов 399

1. Действие токсических

• лекарственных веществ на биосинтез белка

Синтез белка наиболее сложный процесс из всех, протекающих в клетках. Е прерывание или извращение возможно на всех трех уровнях: репликации,

•~ нскрипции или трансляции. Химические вещества, называемые мутагена-

воздействуют на процессы репликации и на структуру транскриптона и

эащают информацию о синтезе полипептидов. Такие мутагены окружаю-

..: среды, как бензоперен и линдан, подавляют синтез ДНК и таким образом

. эывают белок-синтетические процессы. Отмечено влияние токсикантов

. процессы транскрипции. В этом отношении показательно влияние хими-

вских веществ, имитирующих действие эстрогенов, так называемых ксено-

тстрогенов. К ним относятся, например, генистан или госсипол, способные

• :аимодействовать с эстрогеновыми рецепторами и изменять скорость транс-лции.

К лекарственным веществам, эффективно влияющим на синтез белка, от-

. чтся антибиотики. Как правило, они ингибируют процессы транскрипции

мнсляции. Так, противоопухолевые антибиотики — актиномицин В, рубо-

гм лин С, оливомицин, митомицин С — блокируют транскриптон или ингибиру-

РНК-полимеразу. (Кстати, многие противоопухолевые препараты иной

: роды также подавляют синтез белка, например фторурацил.) Большинство

Ьйтибиотиков противобактериального действия ингибируют процессы транс-

Щ^'2'ЛИ.

Такие антибиотики, как норвалин и индолмицин, препятствуют образова-ьею аминоацил-тРНК; стрептомицин, неомицин, конвалин. ауринтрикарбоновая Тйслота ингибируют инициацию трансляции; тетрациклин и стрептограмин ин-

••'"ируют элонгацию, препятствуя связыванию аминоацил-тРНК с А-центром

" комы. Пептидилтрансферазная реакция блокируется пуромицином и хлор-

ачфениколом, а транслокация — эритромицином и биомицином. .? > п?> !-. :ныг : Антибиотики, ингибирующие синтез белка во всех клетках, весь сичны, и многие из них не нашли применения в медицинской практик, тегия разработки новых антибиотиков должна основываться на их ее ном воздействии на бактериальные клетки или же на адресную доставк} » ределенную ткань или орган.

2.

3. Биосинтез заменимых аминокислот

Человек и животные способны синтезировать только 10 из 20 аминокис­лот, необходимых для синтеза белка, — это заменимые аминокислоты (24.2). Пути биосинтеза этих аминокислот разнообразны, но при этом они обладают одним важным свойством:

(|) углеродный скелет аминокислот образуется из промежуточных мета­болитов гликолиза, пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот.

Синтез заменимых аминокислот осуществляется с помощью весьма прос­тых реакций, протекающих, как правило, в одну или две стадии, которые обес­печивают аминирование углеродного скелета предшественника.

Принято выделять три основных пути биосинтеза аминокислот:

• прямое аминирование а-кетокислот или ненасыщенных органических кислот;

• реакции трансаминирования;

• ферментативные взаимопревращения отдельных аминокислот как заме­нимых, так и незаменимых.

Предшественники заменимых аминокислот приведены ниже: На рис. 24.14 приведена схема синтеза девяти заменимых аминокислот, "торые могут образовываться из глюкозы. Десятая аминокислота — тирозин — нтезируется путем гидроксилирования незаменимой аминокислоты фенил-шина. ТА — трансаминирование; ГДГ — глутаматдегидрогеназа

Синтез глутамата из а-кетоглутарата путем восстановительного аминире-вания уже обсуждался, равно как и реакция аминирования глутамата и превра­щения его в глутамин.

Алании синтезируется из пирувата путем трансаминирования, чаще всего с глутаматом. Реакция катализируется ферментом глутаматпируваттрансаминазой: Синтез пролина из глутамата включает следующие превращения: АТФ-за-висимое восстановление до у-полуальдегида; циклизация с отщеплением Н,О и восстановлением НАДФН завершает процесс синтеза пролина: Тирозин, как отмечалось выше, образуется из незаменимой аминокисло­ты фенилаланина путем ее гидроксилирования под действием оксигеназы (фе-нилаланин-4-гидроксилаза) за счет прямого присоединения кислорода: Серии синтезируется из промежуточного продукта гликолиза — 3-фосфо-

шцерата. Вначале происходит его окисление до 3-фосфогидропирувата, за-

:ем трансаминирование с глутаматом с последующим дефосфорилированием: Серии является предшественником глицина и цистеина. При синтезе гли-ша р-углсродный атом серина переносится на тетрагидрофолат (ТГФ) — пе-о носчик одноуглеродных фрагментов: Эта реакция катализируется ферментом серингидроксиметилтрансферазой, простетической группой которого является пиридоксальфосфат. Цистеин синтезируется из серина и гомоцистеина (деметилированного метионина), выступающего донором сульфогруппы. Реакции протекают в две стадии и катализируются также пиридоксальфосфатзависимыми фермента­ми — цистатионсинтазой и цистатиониназой:

№ 31.

1. Классификация и номенклатура ферментов и кофакторов.

2. Эффект разобщения и терморегуляторная функция тканевого дыхания. Термогенная функция адипоцитов бурой жировой ткани. Понятие «гипоэнергетических состояний» и их возможные причины.

3. Декарбоксилирование аминокислот с образованием биогенных аминов. Их медиаторные функции и окислительный распад. Комов 382

1.

2.

3.

Декарбоксилирование аминокислот

Отщепление карбоксильной группы аминокислот в виде СО₂ катализ руется декарбоксилазами аминокислот, которые весьма широко распрост нены в природе. Примеры ферментативного декарбоксилирования аминок лот и их производных у различных видов живых организмов представлен в табл. 24.3.

В животных тканях выявлено декарбоксилирование тирозина, триптс на, 5-окситриптофана, валина, серина, гистидина, глутаминовой и у-оксиг."пл аминовой кислот, 3,4-диоксифенилаланина, цистеина и цистеинсульфинов кислоты, аргинина, орнитина, 5-аденозилметионина, а-аминомалонов кислоты.

Среди различных типов декарбоксилирования аминокислот для орган» ма человека и животных наибольшее значение имеет а-декарбоксилирован* т. е. отщепление карбоксильной группы при а-углеродном атоме и образов ние продуктов реакции аминов, обладающих, как правило, сильным фармако логическим действием и поэтому названных биогенными аминами.

Таблица 24.3. Ферментативное декарбоксилирование аминокислот

и их производных (по Т. Т. Березову и Б. Ф. Коровнику, 1983)

Субстрат	Продукт реакции	Распространение
		живот­ные	расте­ния	микроорга­низмы
5-Аденозилметионин	5-Аденозилгомоцистеамин	+		+
я-Аминобензойная кислота	Анилин			+
а-Аминомалоновая кислота	Глицин	+
а-Аминомасляная кислота	Пропиламин			+
Антраниловая кислота	Анилин			+
I. -Аргинин	Агматин			+
Ь-Аспарагиновая кислота	Р -Алании	+(?)		+
1-Аспарагиновая кислота	а-Аланин			+
Ь-Валин	2-Метилпропиламин	+	+	+
1-Гистидин	Гистамин	+	+
Две молекулы глицина	2СО2 + 2г4Н3 + СН3СООН			+
Ь-Глутаминовая кислота	у-Аминомасляная кислота	+	+	+
\1езо-а; е-диаминопимелиновая	Ь-Лизин			+
кислота
3.4-Диоксифенилаланин	3 ,4- Д иоксифенилэтиламин	+	+	+
Ь-Изолейцин	2-Метилбутиламин		+	+
1-Лейцин	3-Метилбутиламин		+	+
1-Лизин	Кадаверин			+
-Метилен- Ь-глутаминовая	у-Амино-а-метиленмасляная		+
-.ислота	кислота
Норвалин	н-Бутиламин			+
Алло-р-оксиглутаминовая кислота	у-Амино-а-оксимасляная кислота			+
•/-Оксиглутаминовая кислота	а-Окси-у-аминомасляная кислота	+		+
5-Оксилизин	2-Оксикадаверин			+
5-Окситриптофан	Серотонин	+
п -Оксифенилсерин	л-Оксифениламиноэтанол	+
1-Орнитин	Путресцин	+		+
Ь- Серии	Этаноламин	+
[.-Тирозин	Тирамин	+	+	+
1-Триптофан	Триптамин	+
1_-Фенилаланин	Фенил этиламин	+		+
Ь-Цистеиновая кислота	Таурин	+
Ь-Цистеинсульфиновая кислота	Гипотаурин	+

Реакции декарбоксилирования, в отличие от других процессов проме­жуточного обмена аминокислот, являются необратимыми. Декарбоксилазы аминокислот являются сложными ферментами, коферментами которых, как и у трансаминаз, является пиридоксальфосфат (ПФ), специфичность их дейст­вия определяется апобелковым компонентом фермента. Механизм реакции декарбоксилирования аминокислот в соответствии с теорией пиридоксалевого катализа связан с образованием шиффова основания между пиридоксальфос-фатом и аминокислотой, лабилизацией всех связей в субстрате (а, Ъ, с). . обусловливает способность аминокислоты вступать в реакции трансамини вания (а), декарбоксилирования (Ь), альдольного расщепления (с). Неспецифическая декарбоксилаза ароматических аминокислот катализ рует декарбоксилирование триптофана, 5-гидрокситриптофана и 3,4-диокс фенилаланина (ДОФА). Продуктами реакций, помимо СО₂, являются соотве~ ственно триптамин, серотонин и диоксифенилэтиламин (дофамин): Образующиеся биогенные амины — триптамин, серотонин, дофамин об-| ладают сильным фармакологическим действием на множество физиологиче-1 ских функций человека и животных. Так, триптамин и серотонин оказывают ] сосудосуживающее действие. Кроме этого, серотонин участвует в регуляции артериального давления, температуры тела, дыхания и почечной фильтрации является нейромедиатором, который вызывает изменение поведения, напри­мер при шизофрении. Дофамин, возможно, сам является нейромедиатором а также предшественником широко известного медиатора норэпинефрина и гормона адреналина. Источником ДОФА в организме является тирозин, ко­торый под действием специфической гидроксилазы превращается в 3,4-диок­сифенилаланин. Тирозингидроксилаза открыта в надпочечниках, в тканях мозга и периферической нервной системы.

Другим примером образования биологически активных аминов в процес­се декарбоксилирования аминокислот является образование гистамина (из гистидина), большие количества которого выделяются из тучных клеток со-единительной ткани, вызывая аллергическую реакцию в ответ на действие ал­лергена: Количество гистамина увеличивается при различных патологических со­стояниях организма: травмах, стрессе, а также при введении в организм раз­личных ядов и некоторых лекарственных веществ (антибиотиков, лечебных сывороток и др.).

Гистамин обладает широким спектром биологического действия. Много гистамина образуется в очаге воспаления, обладая сосудорасширяющим дей­ствием, он ускоряет приток лейкоцитов и тем самым активирует защитные си­лы в борьбе с инфекцией. Большое количество гистамина образуется в слизис­той желудка, где он активирует секрецию пепсина и соляной кислоты.

Важную биологическую функцию выполняет у-аминомасляная кислота (ГАМК) — продукт а-декарбоксилирования глутаминовой кислоты. Фермент, катализирующий эту реакцию (глутаматдекарбоксилаза), является высокоспе­цифичным: Оба эти соединения — глутамат и ГАМК — относятся к нейромедиаторам: ГАМК ингибирует, а глутамат активирует передачу нервных импульсов. Введе­ние у-аминомасляной кислоты вызывает тормозной процесс в коре головного мозга (центральное торможение), а у животных приводит к утрате условных рефлексов. у-Аминомасляная кислота используется в клинике при лечении некоторых заболеваний ЦНС, связанных с резким возбуждением коры голов­ного мозга.

К биогенным аминам относится также таурин, который образуется из цис-теина и используется в печени при образовании парных желчных кислот: Таким образом, биогенные амины являются сильными, фармакологиче­ски активными веществами, оказывающими разностороннее действие на фи­зиологические функции организма. Некоторые биогенные амины (гистамин,

№ 32

1. Понятия изозимов, компартментации, тканевой и органной специфичности ферментов.

2. Способы использования энергии аккумулированной в клетках.

3. Источники и механизмы образования аммиака в организме. Роль глутамина в его транспорте, биосинтезе небелковых азотистых соединений и обезвреживании. Комов 398

1.

2.

3. Первичная ассимиляция аммиака

Включение аммиака в органические азотсодержащие соединения може* происходить различными путями. Однако у большинства видов живых орга­низмов наиболее важными в количественном отношении являются реакции, катализируемые тремя ферментами — глутаматдегидрогеназой, глутаминсин-тетазой и карбамоилфосфатсинтетазой.

Следует отметить, что характеристика указанных ферментов, так же как и химизм катализирумых ими реакций, была изложена ранее в разделах, отра­жающих роль этих ферментов в метаболических превращениях аминокислот * организме человека и животных (24.7; 24.8). В связи с этим ниже лишь обоб­щен материал по роли глутаматдегидрогеназной, глутамин- и карбамоилсин-тетазной реакций в ассимиляции аммиака и приведено схематическое изобра­жение этих реакций.

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) катализирует образование глутамата из а-ке-тоглутарата и аммиака при участии НАДН • Н⁺ или НАДФН • Н⁺.Важной реакцией, приводящей к включению аммиака в органические со­единения, является также АТФ-зависимое образование глутамина под дейст­вием глутаминсинтетазы: Таким образом, как отмечалось ранее, в организме имеется хорошо функ­ционирующая система, связывающая две молекулы аммиака: Наконец, большое значение имеет реакция, катализируемая карбамоил-фосфатсинтетазой, приводящая к включению аммиака в некоторые биосинте­тические продукты, например в пиримидины (гл. 26) и мочевину (24.7.1). Сте­хиометрия этой реакции описывается уравнением

№ 33

1. Мультиферментные комплексы и полиферментные метаболические пути, как способы организации работы ферментов в клетках про- и эукариот.

2. Микросомальное окисление и его функции. Краткая характеристика моно- и диоксигеназ. Комов 206

3. Схема биосинтеза гема и его функции. Образование, транспорт и конъюгация билирубина. Комов 419

1.

2. Свободное окисление •• 15.4.1 . Общая характеристика

Под свободным окислением понимают реакции, энергия которых не транс­формируется в энергию АТФ.

К таким реакциям относятся реакции микросомального окисления.

Микросомы — это фракция морфологически замкнутых везикул, в кото­рые превращается эндоплазматическая сеть при гомогенизации тканей. В них содержатся активные оксигеназы — ферменты, катализирующие включение кислорода в молекулу субстрата (8).

Известны две подгруппы оксигеназ. Диоксигеназы (истинные оксигеназы), включающие оба атома кислорода в молекулу субстрата: Монооксигеназы (гидроксилазы) включают в субстрат только один атом кислорода, другой атом восстанавливается до воды в присутствии дополни­тельного донора восстановительных эквивалентов (НАДФН или НАДН):

ЗН + 0₂ + НАДФН -Н^{+ монооксигеназа}> 8— ОН + Н₂0 + НАДФ⁺

Ключевая роль в процессах микросомального оксигенирования принадле­жит цитохрому Р-450, представляющему собой, как и все цитохромы, гемо-протеин. Атом железа цитохрома Р-450 (Ре²⁺) восстанавливает связанный в ак­тивном центре фермента кислород, т. е. происходит активация кислорода, ко­торый затем переносится на субстрат. Микросомальное окисление играет важ­ную роль в метаболических процессах, протекающих во всех организмах. Во-первых, это основная детоксицирующая система в организме человека и животных (гл. 32), и, во-вторых, оксигеназы играют определенную роль в ре­акциях анаболизма, например биосинтеза холестерола, стероидных гормонов, желчных кислот, циклических аминокислот и др. Механизм функционирова­ния монооксигеназных ферментных систем изложен в гл. 32.

Свободное окисление, не сопряженное с синтезом АТФ, может протекать и при окислении субстратов в дыхательной цепи митохондрий, например при действии разобщающих агентов — веществ, разделяющих два сопряженных процесса — окисление и фосфорилирование.

3. Метаболизм билирубина и его элиминация из организма включают процесса:

• транспорт билирубина кровью и поступление в паренхимальные кле печени;

• детоксикация билирубина в ЭПР клеток печени;

• секреция билирубина и выведение из организма.