4.3.3. Гель-фильтрация

Гель-фильтрация относится к важнейшим методам, применяемым для очистки ферментов и других белков. Чаще всего она используется на завер­шающих этапах технологических схем выделения и очистки.

Основные принципы метода просты. Гель состоит из открытой попереч­но-сшитой полимерной структуры, сформированной в виде шариков (гранул). Поры внутри гранул имеют такие размеры, что некоторые из них недоступныдля крупных молекул, тогда как более мелкие молекулы могут проникать во все поры. Недоступность пор обусловлена тем, что они или слишком узки для молекул, или, если даже достаточно широки, не имеют каналов, выходящих на поверхность гранул. В настоящее время принято считать оптимальными такие условия потока, при которых все доступные поры заполнены молекулами проходящего по колонке белка. Таким образом, здесь действуют равновесные, а не кинетические факторы.

Поведение молекул в колонке при гель-фильтрации может быть описано несколькими способами. Его можно выразить следующим уравнением:

где К — коэффициент, определяющий долю пор, которые может занимать эта молекула; У_е— объем элюпии рассматриваемой молекулы; У_{— общий объем колонки; К₀ — свободный объем (между гранулами геля).

2. 29.2.1. Активация и рекогниция аминокислот

Большая часть пула аминокислот в цитоплазме клеток находится не в сво­бодном состоянии, а в виде аминоацил-тРНК. Это предохраняет аминокисло­ты от метаболических превращений и способствует сохранению набора ами­нокислот для синтеза белка. Образованию комплекса аминокислота-тРН К предшествует активация аминокислоты и нахождение соответствующей тРНК (рекогниция). Это происходит под действием фермента аминоацил-тРНК-син-тетазы, или АРС-азы. Эти ферменты имеют два активных центра, один из ко­торых соответствует определенной тРНК, а другой строго специфичен соот­ветствующей аминокислоте. Таким образом, в клетке должно быть не менее 20 АРС-аз, хотя фактически их несколько больше. Образование амино-ацил-тРНК происходит в два этапа, первым из которых является взаимодейст­вие аминокислоты (Ах) с макроэргом АТФ: Аминоациладенилат (Ак~АМФ) остается в комплексе с АРС-азой до при­соединения ко второму активному центру фермента тРНК. При взаимодейст­вии комплекса (Ак-АМФ)-АРС-аза с тРНК образуется аминоацил-тРНК (Ак-тРНК); при этом выделяется свободный фермент и АМФ:

(Ак~АМФ)-АРС-аза + тРНК ——>• Ак~тРНК + АМФ + АРС-аза

Рассмотрим это на конкретном примере активации аланина:

3.

№ 14

1. Развитие методов изучения структуры и представлений о белках, как исключительно пластичном классе линейных биополимеров, способном к образованию метастабильных пространственных структур с центрами ком-плементарности к лигандам и другими заданными свойствами.

2. Последовательность событий инициации, элонгации и терминации трансляции. Бесклеточные белоксинтезирующие системы.

3. Активация и общая схема внутриклеточного метаболизма глицерола и жирных кислот.

1.

2.

3.

№ 15

1. Определение, механизм образования, свойства и биологическая роль первичной структуры белков. Их полиморфизм и видовая специфичность, как основа биоразнообразия. Комов 41, 52

2. Основные этапы посттрансляционного процессинга: принцип адресации, избирательный протеолиз, модификации аминокислот, присоединение небелковых компонентов, формирование пространственной конформации и сортировки мономерных и олигомерных белков. Комов 460

3. Схема биосинтеза и функции фосфолипидов и триацилглицеридов. Роль фосфолипаз в обмене фосфолипидов и рецепции внеклеточных сигналов. Комов 292

1. 3.2.1. Определение первичной структуры белков

Определению первичной структуры предшествует денатурация и разрыв поперечных дисульфидных связей в белке. Это достигается посредством из­бытка меркаптоэтанола следующим образом:

Как видно из уравнения, цистин превращается в два остатка цистеина, ко­торые затем блокируют избытком иодуксусной кислоты, чтобы предотвратить обратное образование связей —8—8—.

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т. е. про­странственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует кар­боксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину. Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на не­растворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидроли­за. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипеп-тидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заклю­чающийся в анализе полипептида только с 7У-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стой­кое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицирует­ся хроматографическим методом. После идентификации концевого ТУ-амино-кислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток,

Физико-химические свойства белков

Подобно аминокислотам, белки сочетают в себе как кислотные, так и основные свойства. Являясь амфотерными полиэлектролитами, белки тем не менее существенно отличаются от свободных аминокислот, кислотно-ос­новные свойства которых обусловлены а-амино- и а-карбоксильными груп­пами. В белках основной вклад в формирование кислотно-основных свойств вносят заряженные радикалы аминокислотных остатков, расположенные на поверхности белковой глобулы. Основные свойства белков связаны с такими аминокислотами, как аргинин, лизин или гистидин, а кислые — с аспараги-новой и глутаминовой аминокислотами. Что касается а-аминных и а-кар-боксильных групп аминокислот, то их ионизация не имеет существенного значения, так как подавляющее их число участвует в образовании пептидных связей. Кривые титрования белков достаточно сложны для интерпретации. Это связано, во-первых, с наличием большого числа титруемых групп, а также с тем, что рА"для каждой титруемой группы в белке может существенно от­личаться от таковой в аминокислоте. Это связано с электростатическими взаимодействиями между ионизированными группами белка, наличием близко расположенных гидрофобных остатков, а также влиянием водородных связей.

В процессе титрования белка от предельно кислой до предельно основной формы должно существовать такое значение рН, при котором суммарный за­ряд белка равен нулю. Это значение рН носит название изоэлектрическая точ­ка (р/). При значении рН, равном изоэлектрической точке, белок максималь­но инертен, не перемещается в электрическом поле и имеет наиболее тонкую гидратную оболочку. Большинство белков имеют изоэлектрическую точку при нейтральных или близких к ним значениях рН, однако есть ряд исключений, например, для фермента желудочного сока пепсина р/ = 1,4, а для фермента рибонуклеазы — 10,5. Если в белковом растворе нет никаких ионов, кроме ионизированных аминокислотных остатков, то такие растворы называются изоионными.

Белки, будучи амфотерными электролитами, проявляют буферные свой­ства, хотя их буферная емкость в большинстве случаев незначительна. Исклю­чение составляют белки, содержащие большое число остатков гистидина, например гемоглобин, обеспечивающий стабильные значения рН внутри эрит­роцитов.

Растворимость белков зависит от рН, а также от ионной силы раствора, которая определяется по уравнению

ц = 1/2 !«²,

где ц — ионная сила раствора; с — молярная концентрация; г — заряд иона.

При высокой ионной силе белкового раствора наблюдается конкуренция между белковыми молекулами и ионами соли за молекулы воды. Степень гид­ратации белка снижается, взаимодействие белок— белок при этом становится эффективнее, чем белок— вода, и белок осаждается. Растворимость многих белков при этом связана с ионной силой раствора следующим уравнением:

где /5¹— растворимость, г/л; Р' — растворимость белка в гипотетическом рас­творителе при ионной силе, равной нулю; К₅— константа высаливания.

В растворах белки проявляют коллоидные свойства, такие, как явление светорассеяния (эффект Тендаля), неспособность проходить через полупро­ницаемые мембраны, высокая вязкость, образование гелей и др. Вместе с тем белки не являются истинными коллоидами, так как они способны образовы­вать молекулярные растворы. Основное сходство между коллоидными части­цами и белками заключается в том, что они имеют более или менее близкие размеры. Белки так же, как и истинные коллоиды, могут образовывать гели, представляющие собой сетчатые структуры, заполненные водой.

2. 28.7.3. Терминация транскрипции

Терминация синтеза РНК у прокариот обусловлена наличием на матрице таких последовательностей, которые допускают возможность образования шпильки на транскрипте РНК. При этом связь транскрипта с матрицей зна­чительно ослабляется, что в конечном счете приводит к отделению РНК (рис. 28.7).

У прокариот возможен механизм терминации с помощью специального белка (р-белка), обладающего хеликазной активностью. Этот белок присоеди­няется к транскриптону и движется вслед за РНК-полимеразой. По достиже­нии сайта терминации и образования шпильки скорость движения фермента замедляется, р-белок догоняет РНК-полимеразу и расплетает дуплекс. В ре­зультате транскрипция прекращается, а новосинтезированная РНК отделяется от матрицы. У прокариот первичный транскрипт не претерпевает никаких из­менений и зачастую транскрипция сопряжена с трансляцией.

Механизмы терминации транскрипции у эукариот до конца не изучены. По-видимому, вблизи З'ОН-конца гена с РНК-полимеразой взаимодействует белковый стоп-сигнал, который замедляет (но не прекращает) транскрипцию. Далее фермент катализирует синтез последовательности ААУААА и сле­дующие за ней 15 нуклеотидов, после чего завершает свою работу. В процессе отделения транскрипта от матрицы экзонуклеаза отщепляет терминальные 15 нуклеотидов, а фермент полиА — полимераза достраивает к последователь­ности ААУААА порядка 150—200 полиадениловых нуклеотидов (полиА).

Посттранскрипционный процессинг РНК. После завершения синтеза транс­крипты отделяются от матрицы и подвергаются дальнейшим превращениям или посттранскрипционному процессингу. Транскрипты тРНК и рРНК имеют большие размеры по сравнению с соответствующими зрелыми нуклеиновыми кислотами, и на первой стадии процессинга происходит фрагментация транс­крипта. Затем наблюдается модификация фрагментов, в частности их метили-рование, а также защита 5'- и З'-концов от действия экзонуклеаз. Более сложен механизм процессинга предшественника матричной РНК эукариот или гете-рогенно-ядерной РНК (г-яРНК). После отделения от матрицы г-яРНК проис­ходит модификация ее З'-конца.

Сначала от З'-конца отщепляется около 15 нуклеотидов, затем синтезиру­ются полиадениловые нуклеотиды (полиА) при помощи фермента полиадени-

лат-полимеразы. Как уже было отмечено, в нача­ле транскрипции на 5'-конце РНК-полимераза II катализирует образование кэпа за счет присоеди­нения остатка 7-метилгуанозина. Эти модифика­ции защищают концы мРНК от действия экзо­нуклеаз, кроме того, кэп способствует транспор­ту мРНК в цитоплазму, а также принимает учас­тие в связывании ее с рибосомой. Что касается полиА, то, кроме защиты З'-конца, эта последо-он вательность стабилизирует новосинтезирован­ный транскрипт.

Сплайсинг РНК. В г-яРНК имеется боль­шое количество вставок, которые не имеют смыслового значения. Это так называемые интроны, которые вырезаются из цепи мРНК в процессе ее созревания. Транслируемые участки называются экзонами и составляют цепь зрелой мРНК. Механизм вырезания интронов и сшивания экзонов называется сплайсинг. Механизм точного вырезания интро­нов и сшивания экзонов достаточно сложен. Его интерпретация стала воз­можной после того, как было доказано наличие консенсусных последователь­ностей на границе соединения интронов с экзонами. Основным инструмен­том сплайсинга являются малые ядерные РНК, обладающие ферментативной активностью. Они называются рибозимы. Характерной особенностью рибози-мов является наличие липких концов, комплементарных концам интронов.

Малые ядерные РНК в комплексе со специальными белками образуют сплайсосому, которая осуществляет вырезание интронов и сшивание экзонов. Сплайсосома представляет собой сложный комплекс, состоящий из пяти ти­пов м-яРНК и 50 типов белков. Этот комплекс комплементарно соединяется с консенсусной последовательностью на границе экзон—интрон. Предпо­ложим, что необходимо вырезать интрон, расположенный между двумя экзо­нами. На первом этапе в результате нуклеофильной атаки разрывается связь у 5'-конца интрона, и образуется петля между гуанином на 5'-конце интрона и аденином вблизи З'-конца интрона. Затем вырезается З'-конец интрона, петля освобождается, а экзоны А и Б сшиваются друг с другом под действием РНК-лигаз, входящих в сплайсосому (рис. 28.8).

Следует отметить два важных открытия, связанных с данной проблемой.

* Во-первых, в некоторых случаях рибозимы вырезают интроны само­стоятельно, без помощи белков сплайсосомы. Следовательно, они обладают каталитической активностью и представляют собой уникальное явление, уточ­няя и расширяя представление о том, что биологический катализ осуществля­ется только белками-ферментами.

« Во-вторых, если в первичном транскрипте закодирована информация о нескольких мРНК, то возможно несколько вариантов сплайсинга и образо-

3.

№ 16

1. Пространственная структура (конформация) полипептидов Зависимость формирования ее регулярных (вторичных) и нерегулярных сегментов и свойств от первичной структуры и слабых внутримолекулярных взаимодействий. . Комов30

2. Принципы контроля времени существования и распада матричных РНК и белков. Маркеры стадий онтогенеза и процессов адаптации.

3. Физиологическая роль резервирования и механизмы мобилизации триацилглицеринов в липоцитах белой жировой ткани. Роль липоцитов в управлении «массостатом» организма животных.

1. Вторичная структура белков

Пептидные цепи белков организованы во вторичную структуру, стабили­зированную водородными связями. Атом кислорода каждой пептидной груп­пы образует при этом водородную связь с МН-группой, соответствующей пеп­тидной связи. При этом формируются следующие структуры: а-спираль, р-структура и (3-изгиб.

а-Спираль. Одной из наиболее термодинамически выгодных структур яв­ляется правая а-спираль. На рис. 3.1 изображена а-спираль, представляющая устойчивую структуру, в которой каждая карбонильная группа образует водо­родную связь с четвертой по ходу цепи МН-группой. В а-спирали на один ее виток приходится 3,6 аминокислотного остатка, шаг спирали составляет при­мерно 0,54 нм, а расстояние между остатками — 0,15 нм. В а-спиральных уча­стках торсионные углы ср и у равны 60 и 45° и последовательно расположен­ные полипептидные звенья взаимно ориентированы.

ь-Аминокислоты могут образовывать только правые а-спирали, причем боковые радикалы расположены по обе стороны оси и обращены наружу. В а-спирали полностью использована возможность образования водородных связей, поэтому она не способна в отличие от р-структуры образовывать водо­родные связи с другими элементами вторичной структуры. При образовании а-спирали боковые цепи аминокислот могут сближаться, образуя гидрофобные или гидрофильные компактные сайты. Эти сайты играют существенную роль при образовании трехмерной конформации белковой макромолекулы, так как используются для упаковки а-спиралей в пространственной структуре белка.

Спираль-клубок. Содержание а-спиралей в белках неодинаково и явля­ется индивидуальной особенностью каждой белковой макромолекулы. Для некоторых белков, например для миоглобина, а-спираль лежит в основе структуры, другие, например химотрипсин, не имеют а-спирализованных уча­стков. В среднем глобулярные белки имеют степень спирализации порядка 60—70%. Спирализованные участки чередуются с хаотическими клубками, причем в результате денатурации переходы спираль—клубок увеличиваются. Спирализация полипептидной цепи зависит от аминокислотных остатков, ее образующих. Так, отрицательно заряженные группы глутаминовой кислоты, расположенные в непосредственной близости друг от друга, испытывают сильное взаимное отталкивание, что препятствует образованию соответствую­щих водородных связей в ос-спирали. По той же причине спирализация цепи затруднена в результате отталкивания близко расположенных положительно заряженных химических группировок лизина или аргинина. Большие размеры радикалов аминокислот также являются причиной, по которой спирализация полипептидной цепи затруднена (серии, треонин, лейцин). Наиболее часто интерферирующим фактором при образовании а-спирали является амино­кислота пролин. Как известно, в пролине атом азота входит в состав жесткого кольца, что препятствует вращению вокруг связи М—С_а. Кроме того, пролин не образует внутрицепочечную водородную связь из-за отсутствия при атоме азота водородного атома. Таким образом, во всех случаях, когда в полипептид­ной цепи встречается пролин, а-спиральная структура нарушается и образует­ся клубок или р-изгиб.

Р-Структура. В отличие от а-спирали р-структура образована за счет межцепочечных водородных связей между соседними участками полипептид­ной цепи, так как внутрицепочечные контакты отсутствуют. Если эти участки направлены в одну сторону, то такая структура называется параллельной (ф = —119°, \)/ = +113°) (рис. 3.2), если же в противоположную (ср = -139°, \1/ = +135°), то антипараллельной (рис. 3.3).

Полипептидная цепь в р-структуре сильно вытянута и имеет не спираль­ную, а скорее зигзагообразную форму. Расстояние между соседними амино­кислотными остатками по оси составляет 0,35 нм, т. е. в три раза больше, чем в а-спирали, число остатков на виток равно 2.

В случае параллельного расположения р-структуры водородные связи ме­нее прочны по сравнению с таковыми при антипараллельном расположении аминокислотных остатков. В отличие от а-спирали, насыщенной водородны­ми связями, каждый участок полипептидной цепи в р-структуре открыт для образования дополнительных водородных связей. Сказанное относится как к параллельной, так и к антипараллельной р-структуре, однако в антипарал­лельной структуре связи более стабильны. В отрезке полипептидной цепи, об­разующей р-структуру, находится от трех до семи аминокислотных остатков, а сама р-структура состоит из 2—6 цепей, хотя их число может быть и большим. р-Структура имеет складчатую форму, зависящую от соответствующих а-угле-родных атомов. Поверхность ее может быть плоской и левозакрученной таким образом, чтобы угол между отдельными отрезками цепи составлял 20—25° (рис. 3.4).

р-Изгаб. Глобулярные белки имеют шарообразную форму во многом бла­годаря тому, что для полипептидной цепи характерно наличие петель, зигза­гов, шпилек, причем направление цепи может изменяться даже на 180°. В пос­леднем случае имеет место (3-изгиб (рис. 3.5).

Этот изгиб по форме напоминает шпильку для волос и стабилизируется одной водородной связью. Фактором, препятствующим его образованию, мо­гут быть большие боковые радикалы, и поэтому довольно часто наблюдается включение в него наименьшего аминокислотного остатка — глицина. Эта кон­фигурация оказывается всегда на поверхности белковой глобулы, в связи с чем (3-изгиб принимает участие во взаимодействии с другими полипептидными цепями.

2.

3.

№ 17.

1. Доменная организация структуры гомологичных белков, как основа их функций, эволюции и видовой специфичности. Представления о семействах белков.

2. Экспрессия генов прокариот. Теория оперонов и их функционирование по механизмам индукции и репрессии при адаптации. Энхансеры (усилители) и силенсеры (гасители) операторных участков гена. Комов 471

3. Процессы β-окисления и биосинтеза жирных кислот в клетках.Комов 338

1. Супервторичные стр-ры. Впервые были обнаружены Л. Полингом и Р. Кори. Суперспиральные стр-ры включ. в себя как -спираль, так и -складчатые листы.

Домены — более сложные уровни организации вторичной стр-ры - обособленные глобулярные участки, соединен. др. с др. короткими так назыв. шарнирными участками полипеп­тидной цепи.

Многие белки состоят из нес-ких стр-рных доменов, каждый из к-рых со­держит до 200 аминок-тных остатков (глицеральдегидфосфатдегидрогеназа(ГАФД)).

По строению домены в белках разде­ляют на несколько групп в зависимости от со­держания в них -спиралей и -складчатых листов.

• Водородные связи лабильны и уязвимость их  при образов. вторичной стр-ры, т. к. карбоксильные и аминные гр. могут взаимо­д. не только м/у собой, но и с водой. Вторичная стр-ра до­статочно устойчивой при образовании компактной белковой глобулы.

•Формирован. вторичной стр-ры обус­ловлено последовательностью аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Боковые R, взаимод. др. с др., индуциру­ют процесс образов. пространственной стр-ры, наиболее стабильной ее конформации.

2. Оперон – совокупность генов, способных вкл-ся и выкл-ся в зависимости от метаболич. потребностей кл.

Регуляция синтеза белка у прокариот. В 1961 г. французские исследова-Ф. Жакоб и Ж. Моно впервые провели фундаментальные исследования ии генов, кодирующих р-галактозидазу и связанные с ней ферменты в кишечной палочки Е. соН. Эти исследования помогли им сформулиро-~ гипотезу об опероне и регуляции синтеза белка в клетках прокариот.

роном называется совокупность генов, способных включаться и вы-чггься в зависимости от метаболических потребностей клетки.

>рами впервые были оценены регуляторные механизмы на примере зного или Ьас-оперона, строение которого представлено на рис. 29.5. На участке ДНК, соответствующем оперону, находятся три структурных . у и а). Эти гены кодируют р-галактозидазу, гидролизующую лактозу до зы и галактозы, галактозидпермеазу, переносящую лактозу через клеточ-мембрану, а также галактозидтрансацетилазу, переносящую ацетильный 'К с ацетил-КоА на галактозу. Кроме структурных генов, оперон содер-регуляторные последовательности: ген-оператор, примыкающий к З'-по-ггельности структурного гена, и ген-регулятор, кодирующий белок-реп-|. К гену-оператору примыкает промотор — начальный сайт инициации рипции. Белок-репрессор, взаимодействуя с геном-оператором, частично рует область промотора. Это препятствует присоединению РНК-поли-меразы к промотору, и транскрипция отменяется. При росте Е. соИ на срел. глкжозой лактозный оперон выключен. Его функционирование и регуляи имеют место при выращивании клеток на лактозной среде. Даже в отсутствий галактозидилпермеазы определенное число молекул лактозы поступает в клет-у ку и вступает во взаимодействие с белком-репрессором, находящимся не • ко в свободном состоянии, но и ассоциированным с геном-оператором. В зультате происходит деблокирование промотора и транскрипция станов? возможной. Образование р-галактозидазы приводит к гидролизу лактозы появлению в клетке глюкозы, источника энергии. В результате интенсифика-| ции транскрипции и синтеза р-галактозидазы уменьшается количество индут тора (лактозы) и функционирование Ьас-оперона репрессируется. Таким разом реализуется регуляция по принципу обратной связи. Центральную здесь играет белок-репрессор. Он состоит из четырех субъединиц и имеет, центра связывания: с индуктором-лактозой и геном-оператором. Попере* но (но не одновременно) связываясь с индуктором или с геном-оператор он включает индукцию или репрессию Ьас-оперона.

Имеется еще один механизм регуляции функционирования оперона. бактерии культивировать на среде с глюкозой, то лактозный оперон не фут ционирует. Это обусловлено тем, что какой-то продукт расщепления глюке (катаболит) репрессирует данный процесс. Каков же механизм этой рещ сии? Оказалось, что РНК-полимераза присоединяется к промотору при по» щи специального белка САР (са1аЪоШе §епе асИчапоп ргоШп), комплекс кот го с цАМФ активирует катаболитные гены. Катаболит глюкозы ингибир фермент аденилатциклазу, катализирующую образование цАМФ, комплекс 1 образуется, и индукции лактозного оперона не происходит. Таким обра скорость транскрипции определяется образованием комплексов САР—1 и их связыванием с промотором.

В случае лактозного оперона лактоза — субстрат для р-галактозидазы индуцирует синтез фермента за счет инактивации белка-репрессора и восс новления функционирования оперона. Иное явление наблюдается в проце регуляции синтеза ферментов, осуществляющих образование аминокислс триптофана в той же клетке Е. соН. Механизм регуляции транскрипции заключается в следующем. Белок-

лрессор синтезируется в неактивном состоянии в виде прорепрессора. Ко-

.чный продукт деятельности ферментов — триптофан — является активато-

м белка-репрессора, который после активации взаимодействует с ге-

м-оператором и останавливает транскрипцию (рис. 29.6).

Имеется еще один механизм регуляции, связанный со снижением скорое-

транскрипции, так называемая аттенуация. В клетках Е. соН, как и в других

чтериях, между первым структурным геном и геном-оператором расположе-

лидерная последовательность порядка 140—150 нуклеотидов, так называе-

г!й аттенуатор. Даже небольшой избыток конечного продукта того же трип-

ма приводит к тому, что РНК-полимераза, достигнув аттенуатора, пере-

гранскрибировать оперон. Уменьшение конечного продукта вновь вклю-

транскрипцию.

Что касается трансляции, то у прокариот она играет значительно мень-. ю роль в регуляторных процессах, чем транскрипция.

Энхансеры –

Они влияют на скорость транскрипции независимо от локализации в опероне. Белки взаимод. с энхансерами – энхансерные эл-ты, располож. на расстояние 1000-2000 пар оснований от региона промотора. Эти белковые фак-ры способны воздейств. на инициацию транскрипции при образов. ДНК-петли, что приводит к их сближению.

Силенсеры –

3. -окисление (Ф. Кнооп (1904)) Последовательное отщепление двухуглеродных фрагментов СН₃СООН с карбоксильного конца молекулы. Перед разрывом связи С^-С^ происходит окисление –углеродного атома.

Биохимич. превращен. жирных к-т в процессе –окисления:

-Активация жирной кислоты в цитоплазме клетки.

Активация жирной кислоты является двухстадийным процессом.

Суммарная р-ция:

Жирная к-та + HS-KoA +АТФ Ацил-КоА +АМФ + Пирофосфат

-Транспорт ацильной группы в митохондрии. Внутренняя мембрана ми­тохондрий непроницаема для ацил-КоА, образов-ся в цитоплазме  ацил-КоА+картининHS-KoA+ацилкартинин

После прохождения ацилкарнитина через мембрану митохондрии проис­ходит обратная реакция — расщепление ацилкарнитина при участии мито-хондриального НS-КоА и карнитин-ацилтрансферазы (Е1)

Карнитин возвращается в цитоплазму кл., а ацил-КоА окисляется в митохондриях окислению.

-Последовательность реакций р-окисления ацил-КоА в матриксе мито­хондрий.

1. Р-ция дегидрирования: Ацил-КоА+ФАТтранс-еноил-КоА+ФАТН_2.

2.гидратация ненасыщенного транс-еноил-КоА: транс-еноил-КоА+водаL---гидроксиацил-КоА

3. Р-ция дегидрирования: L---гидроксиацил-КоА + НАД⁺-кетоацил-КоА+НАДН*Н⁺

4. реакции тиолитического расщепления: -кетоацил-КоА+HS-КоА ацил-КоА+ацетил-КоА. Укорочен­ный ацил-КоА вновь вступает в следующий цикл - окисления (7 циклов -окисления)  образ. 8 мол-л ацетил-КоА

Суммарное ур-ние окисления активированной пальмитиновой к-ты:

Пальмитиновая к-та + 7HS-КоА +7ФАД+7НАД⁺+7воды8ацетил-КоА+7ФАДН²+НАДНН⁺

-Энергетика окисления жирных кислот. выделяется большое кол-во метаболической энергии. А полное окисление образовавшиеся молекулы ацетил-КоА сопровождается синтезом 12 молекул АТФ в расчете на окисление одной молекулы ацетила. НАДН и ФАДН₂ окисляются в митохондриальной дыхательной цепи. При окислении НАДН синтезируют­ся 3 АТФ, а ФАДН₂ — 2 АТФ  синтезируется 5 АТФ.

Биосинтез жирных кислот

Структурным предшественником для синтеза жирных кислот явл ацетил-КоА. Это соединение образуется в матриксе митохондрий преиму! ственно из пирувата, в результате реакции его окислительного декарбоксу рования, а также в процессе (3-окисления жирных кислот. Следовательно, леводородные цепи собираются в ходе последовательного присоединег двухуглеродных фрагментов в форме ацетил-КоА, т. е. биосинтез жирных ] лот происходит по той же схеме, но в противоположном направлении по I нению с р-окислением.

Однако существует ряд особенностей, различающих эти два проце благодаря которым они становятся термодинамически выгодными, необра! мыми и по-разному регулируются.

Следует отметить основные отличительные особенности анаболизма жир­ных кислот.

• Синтез насыщенных кислот с длиной углеводородной цепи до С₁₆ (паль­митиновая кислота) в эукариотических клетках осуществляется в цитозоле клетки. Дальнейшее наращивание цепи происходит в митохондриях и частич­но в ЭПР, где идет превращение насыщенных кислот в ненасыщенные.

• Термодинамически важным является карбоксилирование ацетил-КоА и превращение его в малонил-КоА (СООН—СН₂—СООН), на образование ко­торого затрачивается одна макроэргическая связь молекулы АТФ. Из восьми молекул ацетил-КоА, необходимых для синтеза пальмитиновой кислоты, только одна включается в реакции в виде ацетил-КоА, остальные семь в виде малонил-КоА.

• В качестве донора восстановительных эквивалентов для восстановления кетогруппы до гидроксигруппы функционирует НАДФН, в то время как при обратной реакции в процессе р-окисления восстанавливается НАДН или ФАДН₂ в реакциях дегидрирования ацил-КоА.

• Ферменты, катализирующие анаболизм жирных кислот, объединены в единый мультиферментный комплекс, получивший название «синтетаза выс­ших жирных кислот».

• На всех этапах синтеза жирных кислот активированные ацильные остат­ки связаны с ацилпереносящим белком, а не с коэнзимом А, как в процессе Р-окисления жирных кислот.

Транспорт внутримитохондриального ацетил-КоА в цитоплазму. Аце­тил-КоА образуется в клетке преимущественно в процессе внутримитохонд-риальных реакций окисления. Как известно, митохондриальная мембрана не­проницаема для ацетил-КоА.

Известны две транспортные системы, обеспечивающие перенос аце-тил-КоА из митохондрий в цитоплазму: ацил-карнитиновый механизм, опи­санный ранее, и цитрат-транспортная система (рис. 23.14).

В процессе транспорта внутримитохондриального ацетил-КоА в цито­плазму по цитратному механизму вначале происходит его взаимодействие с оксалоацетатом, который превращается в цитрат (первая реакция цикла три-карбоновых кислот, катализируемая ферментом цитратсинтазой; гл. 19). Спе­цифической транслоказой образовавшийся цитрат переносится в цитоплазму, где расщепляется ферментом цитратлиазой при участии коэнзима А на окса-лоацетат и ацетил-КоА. Механизм этой реакции, сопряженной с гидролизом АТФ, приведен ниже:

транспорт в митохондрии

В связи с тем что для оксалоацетата мембрана митохондрии непронииа. ма, уже в цитоплазме он восстанавливается посредством НАДН в малат, кот рый при участии специфической транслоказы может вернуться в матрикс м тохондрии, где окисляется до оксалатацетата. Таким образом, завершается т называемый челночный механизм транспорта ацетила через метохондриальн мембрану. Часть цитоплазматического малата подвергается окислительно' декарбоксилированию и превращается в пируват с помощью особого «малик фермента, коферментом которого является НАДФ⁺. Восстановленный НАДФ наряду с ацетил-КоА и СО₂ используется в синтезе жирных кислот.

(I) Обратите внимание, что цитрат транспортируется в цитоплазму ли__: тогда, когда его концентрация в матриксе митохондрии достаточно е-лика, например при избытке углеводов, когда цикл трикарбоновых ки лот обеспечен ацетил-КоА.

Таким образом, цитратный механизм обеспечивает как транспорт аие-тил-КоА из митохондрии, так и примерно на 50% потребности в НАДФН, ко- , торый используется в восстановительных реакциях синтеза жирных кислот.! Кроме этого, потребности в НАДФН восполняются также за счет пентозофос-] фатного пути окисления глюкозы. ,

Образование малонил-КоА. Первым этапом в синтезе жирных кислот является образование малонил-КоА из ацетил-КоА и СО₂, т. е. происходит АТФ-зависимое карбоксилирование ацетил-КоА.

Биологическая роль этого процесса заключается в активации группы СН₃ ацетил-КоА путем превращения в более реакционную метиленовую (СН₂) малонил-КоА. Эта реакция катализируется ферментной системой — аце-тил-КоА-карбоксилазой, коферментом которой является биотин (витамин Н), активатором — ионы марганца (Мп²⁺). Суммарную реакцию карбоксилирова-ния ацетил-КоА можно записать следующим образом:

Ацетил-КоА-карбоксилаза — это мультиферментный комплекс, состоя­щий из трех белков: биотин-переносяший белок (БПБ), к которому присоеди­нен ковалентной пептидной связью биотин, и два фермента: биотин-карбокси-лаза (БК) — карбоксилирует биотин с образованием карбоксибиотина, содер­жащего высокоактивированную группу СО₂; второй фермент — карбоксил-трансфераза (КТ) осуществляет реакцию переноса активированного СО₂ на ацетил-КоА. Ниже приведена схема ковалентного комплекса биотина и био-тин-переносящего белка.

Продукт реакции — малонил-КоА является активированным донором ацетил-КоА, молекулы которых должны последовательно соединяться в про­цессе синтеза жирных кислот.

Ацетил-КоА-карбоксилаза является важнейшим регуляторным ферменте^ч всего процесса синтеза жирных кислот. По аллостерическому механизму он активируется цитратом и ингибируется длинноцепочечными ацил-КоА-про изводными.

Мультиферментный синтетазный комплекс жирных кислот. Все фер менты биосинтеза жирных кислот образуют единый агрегат — мультифер-ментный комплекс, получивший название синтетазы жирных кислот. Комп­лекс синтетазы животных тканей и дрожжей — это димер, состоящий из дв\^ идентичных мономеров, каждый из которых представляет полипептидную цепь, включающую шесть активных центров ферментов и ацил-переносящип белок (Н8-АПБ). Эти ферменты образуют настолько компактную структур), что они не поддаются фракционированию и все попытки выделить их в инди­видуальном виде не увенчались успехом.

Другой тип структурной организации ферментов синтеза жирных кислот встречается у микроорганизмов и растений, из которых отдельные ферменты могут быть выделены методами белкового фракционирования.

Структура мономера синтетазы жирных кислот. В состав синтетазы входит ацил-переносящий белок (Н8-АПБ). Он имеет молекулярную массу около 10 кОа; сравнительно термостабилен; содержит фосфорилированную пан-1 тотеновую кислоту (витамин В₃) и тиоэтиламин, ковалентно присоединенные к полипептидной цепи АПБ через сериновый остаток фосфоэфирной связью Следует отметить, что та же самая группировка входит в состав Н8-КоА:

Реакционной группой АПБ является Н8-группа, поэтому его приня обозначать в виде Н8-АПБ. В синтетазной системе этот белок выполня функцию, сходную с Н8-КоА, т. е. участвует в передаче ацильных радикалов одного фермента к другому.

Ферменты синтетазного комплекса (в скобках обозначены номера катат; зируемых ими реакций) приведены ниже:

• ацетил (или ацил)-АПБ-трансфераза (1);

• малонил-АПБ-трансфераза (2);

• (3-кетоацил-АПБ-синтаза (конденсирующий фермент) (3);

• (3-кетоацил-АПБ-редуктаза (4);

• р-гидрокси-АПБ-дегидратаза (5);

• еноил-АПБ-редуктаза (6).

В процессе биосинтеза жирных кислот для проявления синтетазной а г тивности необходимо участие двух сульфгидрильных групп комплекса. Оль реакционная Н8-группа принадлежит Н8-АПБ одного мономера, другая -остатку цистеина, входящего в состав р-кетоацил-АПБ-синтазы другого мои' мера, которые расположены в непосредственной близости друг от др\ В связи с этим синтетазный комплекс активен только в виде димера. Г скольку каждый из мономеров включает все ферменты синтетазного

одновременно на димере идет синтез двух молекул жирных кислот. В при-.енных ниже реакциях этот комплекс схематически может быть изображен л\тощим образом:

Центральную роль в синтезе жирных кислот в цитозоле при участии фер­тов синтетазного комплекса играет синтез пальмитиновой кислоты

- (СН₂)₁₄СООН, поскольку последующее наращивание цепи насыщенной гной кислоты происходит в митохондриях путем обращения реакций

•лтсления.

В реакции 1 (рис. 23.15) идет перенос ацетила на сульфгидрильную группу цистеина, малонил же взаимодействует с соседней Н5-группой АПБ, локали­зованного на другом мономере (реакция 2). Центральной реакцией является реакция конденсации (3) ацетила с метиленовой группой малонила, сопро­вождающаяся отщеплением СО₂. В результате происходит образование четы-рехуглеродного ацильного остатка и высвобождение Н8-группы цистеина, ра­нее занятой ацетильной группой. Декарбоксилирование в этой реакции имеет энергетическое значение, позволяет реакции пройти до конца и, таким обра­зом, является движущей силой биосинтеза. В последующем идет восстановле­ние (3-кетоацильной группы (реакция 4), затем дегидратация (реакция 5) и вновь восстановление ненасыщенного от/ганс-еноил-АПБ, в результате чего _; образуется насыщенный ацил-АПБ (реакция 6). Три последние реакции сход­ны с соответствующими обратными реакциями р-окисления, отличаются об-1 разованием в четвертой реакции в-изомера р-гидроксикислоты, а не Ь-изоме-ра, а также тем, что восстановителем является НАДФН, а не НАДН. Заверша­ется первый этап синтеза перемещением насыщенного ацильного радикала на свободную НЗ-группу цистеина, а новая молекула малонил-КоА взаимодейст­вует с Н8-АПБ, цикл реакций повторяется еще шесть раз, и каждый новый ос- ] таток малоната, декарбоксилируясь, встраивается в углеродную цепь до те пор, пока не образуется 16-углеродный пальмитоил-АПБ (рис. 23.16). Заве шается синтез кислоты гидролитическим отщеплением Н8-АПБ от пальми ил-АПБ при действии фермента деацилазы, не входящей в состав комплек. синтазы жирной кислоты.

№ 18

1. Особенности строения, стабилизации и преимущества функционирования белков олигомерной (четвертичной структуры). Понятие кооперативных эффектов. Комов 39

2. Управление биосинтезом белков в клетках эукариот с помощью альтернативного процессинга мРНК, ее транспорта в цитоплазму и контроля стабильности. Механизмы перестройки генов, их амплификации и полиплоидии при дифференцировке клеток многоклеточного организма.

3. Структура, свойства и функции холестерола. Схема его биосинтеза и превращения в стероиды разных классов.Комов 350