Аналитические основы энзимологических исследований.

Основным биологическим материалом для исследования активности ферментов в клинике является сыворотка крови. Правила забора такие же, как и для других биологических исследований. Хранение сыворотки, как правило, сопровождается снижением активности ферментов. Для большинства из них активность не изменяется при комнатной температуре в течение 6-8 часов, при 4⁰С - около недели, в замороженном состоянии - в течение месяца. Следует учитывать, что многие антикоагулянты способны ингибировать активность ферментов.

Активность ферментов в сыворотке крови превышает таковую в плазме из-за выделения в процессе свертывания и ретракции сгустка содержащихся в тромбоцитах биологически активных веществ, влияющих на ферменты плазмы крови. Более того, при лизисе эритроцитов в сгустке находящиеся в них ферменты переходят в сыворотку крови. Этим объясняется большая активность ЛДГ у практически здоровых людей в сыворотке, чем в плазме крови.

Методы определения ферментов в биологическом материале имеют свою специфику, которая обусловлена очень низкой концентрацией ферментов в тканях. Обычными методами количественного анализа, используемыми в КДЛ, эту концентрацию измерить невозможно. Поэтому о количестве ферментов судят косвенно, по скорости катализируемой ими реакции, что пропорционально количеству преобразованного субстрата, либо количеству образовавшегося продукта реакции, т.е. определяется активность фермента.

Активность ферментов принято обозначать количеством преобразованного им субстрата (образовавшегося продукта) в пересчете на 1л биологического материала за определенную единицу времени.

За одну единицу активности фермента международный биохимический союз предлагает назвать то количество молей субстрата, которое превращает энзим за 1 секунду. Эта единица называется катал.

1 катал=мольS/сек

1 катал/л=мольS/секл

Повышение активности ферментов в плазме (сыворотке) крови при целом ряде заболеваний связно, прежде всего, с цитолизом (увеличением проницаемости плазматической мембраны, мембран лизосом и некрозом клеток и последующим выходом энзимов из поврежденных органов и тканей в кровяное русло). При этом содержание и активность ферментов в поврежденном органе снижается, а в сыворотке (плазме) крови повышается. Полагают, что благодаря общей реакции организма ферменты переходят в плазму не только из поврежденного органа, но также и других органов и тканей, не затронутых патологическим процессом.

Клинико-диагностическое значение исследования отдельных ферментов в сыворотке крови асат, алат.

Это ферменты, катализирующие обратимую реакцию переноса NH₂-группы между -кетоглутаровой кислотой и, соответственно, аспарагиновой кислотой и аланином.

В тканях ряда органов содержится значительное количество трансаминаз - в сотни и тысячи раз превышающее уровень активности данных ферментов в сыворотке крови.

Особенно высоким содержанием АСАТ отличается сердце, печень, мышцы, поджелудочная железа.

АЛАТ в наибольшем количестве обнаруживается в печени, поджелудочной железе, сердце, скелетных мышцах.

Пристального внимания клиницистов привлек факт весьма значительного повышения активности АСАТ в сыворотке крови при инфаркте миокарда. Степень наступающей гиперферментемии тем выше, чем массивнее инфаркт миокарда. Исследование трасаминазной активности сыворотки в динамике позволяет выявить характерную кривую.

Начало подъема - ч/з 2-5 часов после возникновения заболевания. Достижения так - к концу 1-ых суток - 27-36 часов и последующие постепенное снижение до нормы в течение 3-7 суток.

Степень гипер-АСАТ-емии и характер кривой имеет не только диагностическое, но и прогностическое значение. При очень тяжелых инфарктах миокарда гипертрансаминаземия может затягиваться на несколько недель. Имеются данные, что повышение активности АСАТ и ЛДГ наблюдаются и при таких инфарктах миокарда, которые не диагностируются на ЭКГ. Повышение активности трансаминаз при различных видах сердечной недостаточности (ИБС, за исключением инфаркта, пороков), как правило, не регистрируется или носит умеренный характер.

Таким образом, определение активности трансаминаз следует отнести к достаточно чувствительным дифференциально-диагностическим тестам.

Высокими гипертрансаминаземиями сопровождаются повреждения паренхимы печени, связанные с воспалительными и некротическими процессами. Так, кривая ферментативной активности при данном заболевании обнаруживается максимум на 6-10 сутки и постепенный возврат к норме к 20-м суткам при гепатитах средней тяжести. Повышение АСАТ и АЛАТ наступает раньше и утихает раньше, чем гипербилирубинемия, т.е. гипертрансаминаземия наблюдается уже в дожелтушную стадию вирусного гепатита. Характерным для заболевания печени является более значительное повышение АЛАТ.

Норма: АЛАТ 0,1-0,68 ммоль/чл

АСАТ 0,1-0,45 ммоль/чл

Коэффициент де Ритиза АСАТ/АЛАТ=0,60 (у здоровых людей).

У больных вирусным гепатитом он ниже, а при инфаркте миокарда резко повышается.

Следует отметить, что механические желтухи, холангиты и ряд других заболеваний печени обычно не сопровождаются повышением трансаминазной активности.

В то же время метастазы рака в печень характеризуется гипертрансаминаземией, причем степень ее соответствует распространению опухоли. У взрослых исследовании активности АЛАТ и АСАТ применяют и при инфарктах миокарда, и при гепатитах. Для педиатра это имеет значение при паренхиматозных заболеваниях печени, особенно при гепатитах.

Повышение активности АЛАТ и АСАТ отмечается и при острых панкреатитах, однако диагностическая ценность определения данных ферментов при панкреатитах в силу большой распространенности трансаминаз значительно меньше, чем -амилазы. Наконец, высокое содержание трансаминаз в мышцах объясняет появление гиперферментемии при обширных травмах, гангрене, прогрессирующей мышечной дистрофии.

Подобные гипертрансаминаземии не имеют самостоятельного диагностического значения, но должны учитываться при трактовке результатов трансаминазного теста.

ЛДГ.

Это гликолитический фермент, катализирующий обратимую реакцию окисления лактата в пировиноградную кислоту в присутствии НАДН. Энзим широко распространен в организме человека. По степени убывания активности энзима органы и ткани располагаются в следующем порядке: почки, сердце, мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, эритроциты (поэтому гемолизированную сыворотку для исследования не используют). Активность ферментов характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в организме.

ЛДТ сыворотки крови повышаются при;

• повреждениях миокарда;

• лейкозах;

• почечных заболеваниях;

• тромбоцитопениях;

• инфекционном мононуклеозе;

• повреждении паренхимы печени;

• опухолях;

• прогрессивной мышечной дистрофии;

• гемолитических и мегалобластических анемиях.

При инфаркте миокарда активность ЛДГ в сыворотке крови повышается через несколько часов, спустя 24-36 часов достигает максимума. Приблизительно через 10 суток активность ЛДГ становится нормальной. При приступе стенокардии цифры активности ЛДГ остаются в пределах нормы.

Диагностическую ценность имеет определение изоэнзимов ЛДГ методом электрофореза на крахмальном, агаровом или полиакриламидном геле. Установлено, что ЛДГ состоит из 4-х субъединиц 2-х типов - Н и М, и возможно образование 5 изоферментов или фракций.

4Н	ЛДГ1
3Н1М	ЛДГ2
2Н2М	ЛДГ3
1Н3М	ЛДГ4
4М	ЛДГ5.

В ходе электрофореза выявлено, что наиболее медленной является фракция ЛДГ₅, наиболее быстрой ЛДГ₁.

В количественном отношении (по содержанию в сыворотке крови) фракции изоферментов расположены в следующем порядке:

ЛДГ₂>ЛДГ₁>ЛДГ₃>ЛДГ₄>ЛДГ₅

Установлено, что фракция ЛДГ₁ происходит в основном из ткани сердца, ЛДГ₅ - из печени, ЛДГ₃ - из поджелудочной железы и легких ; ЛДГ₂, ЛДГ₃ и ЛДГ₄ увеличивают свое содержание в плазме крови при значительном разрушении тромбоцитов (эмболия легочной артерии, массивные гемотрансфузии и др.). При инфаркте миокарда в большей степени повышается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂. Существуют наборы для определения ЛДГ₁+ЛДГ₂ (-гидроксибутиратдегидрогеназы, или -ГБДГ).

При остром гепатите активность ЛДГ (ЛДГ₅ и ЛДГ₄) в сыворотке сильно повышена наряду с трансаминазами, что свидетельствует о тяжелом течении болезни. Большое значение имеет определение активности ЛДГ в сыворотке крови при безжелтушных гепатитах.

При холецистите ЛДГ₅ повышается незначительно.

Формирование некротического панкреатита сопровождается повышением активности ЛДГ₁,ЛДГ₂ и ЛДГ₃. У больных с острым панкреатитом, развившимся на фоне желчекаменной болезни, наряду с повышением ЛДГ₁ и ЛДГ₃, повышается и ЛДГ₅.

При ЖКБ без обтурации желчных ходов повышения активности ЛДГ не отмечено, тогда как у больных с обтурационной желтухой вследствие опухоли, билиарного цирроза, с опухолями поджелудочной железы оно резко повышено.