Преодоление последствий Чернобыль

УДК 616-097:577.213.32

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ВЫЯВЛЕНИЯ НАРУШЕНИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ОСНОВЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛЬЦЕВЫХ СТРУКТУР TREC И KREC

М. В. СТЁГАНЦЕВА, И. Е. ГУРЬЯНОВА, младшие научные сотрудники, С. О. ШАРАПОВА, канд. биол. наук,

М. В. БЕЛЕВЦЕВ, канд. биол. наук, доцент Республиканский научно-практический центр детской онкологии,

гематологии и иммунологии г. Минск, Республика Беларусь

Первичные иммунодефициты (ПИД) – группа заболеваний, в основе которых лежат врожденные, генетически детерминированные, нарушения функций иммунной системы. В настоящее время описано уже более 140 генетических дефектов, определяющих развитие различных форм ПИД. Распространенность ПИД, по данным Европейского общества по первичным иммунодефицитам (ESID), составляет один случай на 25–100 тыс. чел. [1]. Диагностика ПИД на сегодняшний день затруднена в связи с высокой гетерогенностью симптомов и молеку- лярно-генетических характеристик. В то время как множество генетических дефектов идентифицировано, постановка молекулярного диагноза для многих пациентов затруднена [2]. Различные варианты генетических нарушений в генах, ответственных за развитие заболевания, могут привести к разнообразным клиническим проявлениям [3]. В связи с этим необходим новый дополнительный метод для ранней идентификации заболевания и собственно диагностики с возможностью оценки вероятных осложнений.

Одним из новых методов, получивших широкое распространение в последние несколько лет, является количественная оценка кольцевых молекул ДНК, которые образуются на ранних стадиях созревания лимфоцитов в процессе реаранжировки уникального Т- и В-клеточного рецептора. Для Т-лимфоцитов такой фрагмент имеет название «ТREC». Эта аббревиатура расшифровывается как T-cell receptor rearrangement excision circles. Процесс перестройки генов рецептора осуществляется за счет двухцепочечных разрывов ДНК, вносимых RAG1 и RAG2 на границе двух генных сегментов, окруженных сигнальной последовательностью рекомбинации. Образующиеся последо-

101

вательности генных сегментов лигируются с образованием кодирующего и сигнального соединений, последнее из которых замыкается в кольцо. Это стабильные продукты, которые не реплицируются в клетке, не дуплицируются в процессе митоза и соответственно разводятся в процессе клеточного деления, в то время как специфический рецептор наследуется дочерними клетками [4].

Возможность применения данного метода для диагностики иммунодефицитных состояний обусловлена рядом факторов. Во-первых, сигнальные последовательности рекомбинации RSS, которые являются сайтом узнавания для рекомбиназ, консервативны и имеют лишь незначительные межвидовые различия. В норме они разделены генными сегментами и только после реаранжировки следуют друг за другом. Это позволяет с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени амплифицировать необходимый участок ДНК. Во-вторых, в связи с тем что реаранжировка рецептора происходит на ранних этапах созревания лимфоцитов, по количеству копий TREC/KREC мы можем оценить эффективность генерации лимфоцитов и пополнение пула периферических клеток со сформированным антигенраспознающим рецептором. Одним из важнейших достоинств метода, является то, что анализ может быть проведен ретроспективно, так как материалом исследования являются не нативные клетки, а выделенная из них ДНК. Кроме того, при необходимости диагноз может быть поставлен postmortem. Данная методика требует минимального количества исходного материала, в связи с высокой чувствительностью используемого лабораторного оборудования, является высокопроизводительной, занимает мало времени и не требует специальных аналитических программ и высокотехнологичного оборудования.

Определение копийности эксцизионных колец может быть использовано в следующих случаях:

1.Скрининг тяжелой комбинированной иммунной недостаточности (ТКИН) и агаммаглобулинемий у новорожденных. Это вошло в повседневную практику медицинских учреждений США и Европы и, безусловно, приносит свои плоды.

2.Оценка восстановления тимопоэза после трансплантации стволовых клеток костного мозга и генной терапии. После трансплантации количество ТРЕК быстро возрастает в течение периода раннего восстановления Т-клеточного пула до супранормальных значений.

3.Оценка антиретровирусной терапии у пациентов с ВИЧ и химиотерапии у онкологических больных.

102

4.Классификация больных с общей вариабельной иммунной недостаточностью (ОВИН).

5.Изучение созревания и репликации В-лимфоцитов.

6.ТРЕК также показывает происхождение Т-лимфоцитов, 70 % лимфоцитов, мигрирующих из тимуса в периферический кровоток, несут сигнальный ТРЕК, который является продуктом реаранжировки генов альфа-цепи ТКР. Теоретически ТРЕК-позитивные Т-лимфоциты могут продуцироваться и в экстратимических зонах, например в кишечнике, однако их количество там чрезвычайно мало. Так, у пациентов с врожденным отсутствием тимуса, как в случае полного синдрома Ди Джорджи, ТРЕК не детектируются вовсе и появляются только после трансплантации и восстановления тимуса.

Объектом исследования послужили образцы ДНК костного мозга

ипериферической крови 41 пациента с диагнозом первичный иммунодефицит. Информация о пациентах представлена в таблице. Клетки для молекулярно-генетического анализа выделяли методом осмотического лизиса эритроцитов. ДНК выделяли методом фенол-хлорофо- рмной экстракции.

Иммунофенотипическая и молекулярно-генетическая характеристика пациентов с врожденным иммунодефицитом

*Указаны гены, в которых найдены патогенетические мутации (полиморфизмы). Каждый из пациентов имеет дефекты только в одном гене.

**Не выявлено.

103

Проточная цитофлюориметрия. В рамках первичной диагности-

ки было произведено иммунофенотипирование пациентов в рамках расширенной панели клеток.

Молекулярно-генетическая диагностика. Для дифференциально-

го диагноза все пациенты были проверены на наличие мутаций в целевых генах, задействованных при определенных типах иммунодефицитов. Общая панель маркеров включает следующие гены: RAG1, RAG2, Jak3, CD40L, Was, ELA-2, ATM, FoxP3, C1N1, CYBB, FAS, IL7-R, IL2-RG, SH2D1A, BTK, ADA, AIRE, XIAP, GATA-2, CoroninA, TACi, ICOS, ITK, Lig4, NBS1. Наличие мутаций (полиморфизмов) определяли методом прямого секвенирования (Applied Biosystems).

Приготовление стандартов. Фрагмент ДНК TREC был амплифи-

цирован в ПЦР-реакции, продукт очищен набором Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen). Полученный фрагмент лигировали с плазмидой pTZ57R (Fermentas) в соотношении 3:1. Полученную конструкцию трансформировали в компетентные клетки E. coli. Концентрацию выделенной плазмидной ДНК со встроенным целевым фрагментом TREC определяли методом гельэлектрофореза и создавали плазмидные стандарты в концентрации 101–106.

Количественное определение TREC. Количество копий TREC

определялось с использованием ПЦР-РВ в двух вариантах. Абсолютное количество копий устанавливали с использованием плазмидных стандартов. Относительное количество определяли методом 2–∆∆Ct. Для нормализации экспрессии использовали ген альбумин. В качестве калибратора использовали среднее арифметическое трех здоровых доноров соответствующей возрастной группы.

В исследование был включен 41 пациент с различными иммунодефицитными состояниями. Медиана возраста составляет 5 месяцев (от 24 дней до 14 лет). Из них 36 прошли процедуру иммунофенотипирования, так как пяти пациентам диагноз был поставлен посмертно. У 18 пациентов дополнительно было определено абсолютное и относительное количество тимических мигрантов. Количество TREC было определено у 36 пациентов, и их содержание было значительно ниже по сравнению с контрольной группой здоровых доноров (р = 0,01). Насколько собственно количество TREC соответствует тимическим мигрантам можно рассмотреть на примере пациентов с синдромом Ниймегена. Данный синдром был диагностирован у 15 пациентов. Иммунофенотипирование сделано только 10 пациентам, так как 5 из них диагностированы посмертно. Все они имели дефекты Т- и В-клеточного звена иммунитета, однако большинство из них имели нормальный абсолютный и относительный уровень CD3+ лимфоцитов

104

и низкие или вовсе отсутствующие тимические мигранты. ТРЕК у этих пациентов либо крайне мало, либо они не детектируются вовсе. Сравнение количества тимических мигрантов и TREC выявило высокую прямую корреляцию (R = 0,89; p < 0,05).

Методика количественного определения копий TREC успешно применяется для оценки функционирования Т-клеточного звена иммунитета. Наличие высокой корреляции количества копий TREС и тимических мигрантов позволяет судить об эффективности тимического выхода.

ЛИТЕРАТУРА

1.ESID Online Database for Primary Immunodeficiency Diseases User Manual. – Version 3. – 2011. – P. 1–25.

2.PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research,

diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders / M. C. Zelm [et al.] // Frontiers in Immunology. – 2011. – Vol. 2. – P. 1–9.

3.Artemis spliced efects cause atypical SCID and can be restored in vitro by an antisense oligonucleotide / I. J. Speert [et al.] // GenesImmun. – 2011. – Vol. 16. – P. 1036–1044.

4.Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen induced B-cell expansion / M. C. Zelm [et al.] // J. Exp. Med. – 2007. – Vol. 204. – P. 645–655.

5.Test Definition: TREC T-Cell Receptor Excision Circles (TREC). Analysis for Immune Reconstitution / Mayo Clinic.

Сек ция 2. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ВЕДЕНИЯ АГРАРНОГО ПРОИЗВОДСТВА И ЛЕСНОГО ХОЗЯЙСТВА В УСЛОВИЯХ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

УДК 630:332.368

КВОПРОСУ О РЕАБИЛИТАЦИИ ЛЕСОВ ЗОН ОТСЕЛЕНИЯ

ВКОНТЕКСТЕ СОЗДАНИЯ ЕДИНОЙ КОНЦЕПЦИИ УПРАВЛЕНИЯ ЗОНАМИ ОТЧУЖДЕНИЯ И ОТСЕЛЕНИЯ

СОЮЗНОГО ГОСУДАРСТВА

Н. И. БУЛКО, И. А. МАШКОВ, Н. В. ТОЛКАЧЕВА, кандидаты с.-х. наук, Н. В. МОСКАЛЕНКО, А. К. КОЗЛОВ, научные сотрудники ГНУ «Институт леса» НАН Беларуси

г. Гомель, Республика Беларусь

Преодоление последствий природных и техногенных катастроф, в том числе последствий аварии на ЧАЭС, является одной из приоритетных задач социально-экономического развития Союзного государства.

105

В настоящее время площадь территории радиоактивного загрязнения лесного фонда Министерства лесного хозяйства Республики Бела-

русь составляет 1424,8 тыс. га (15 % от общей площади), в том числе: с плотностью загрязнения почв 137Cs от 1 до 5 Ки/км2 – 993,4 тыс. га, от

5 до 15 Ки/км2 – 301,7 тыс. га, от 15 до 40 Ки/км2 – 127,7 тыс. га, 40 Ки/км2 и более – 2,0 тыс. га. С 2010 г. по настоящее время территория радиоактивного загрязнения лесного фонда уменьшилась на

164,6 тыс. га (10,3 %).

Внаибольшей степени загрязнены радионуклидами леса Гомельской (49,6 % от всей территории лесного фонда) и Могилевской области (34 %).

В11 лесхозах Министерства лесного хозяйства часть лесов отнесе-

на к зонам отселения (с плотностью загрязнения 15–40 Ки/км2 и 40 Ки/км2 и более), на территориях которых ограничены лесохозяйственная деятельность и лесопользование, нарушена лесная дорожная сеть, а также существуют проблемы с обеспеченностью кадрами. В связи с отселением населенных пунктов произошло увеличение площади лесничеств, что затрудняет выполнение противопожарных мероприятий в полном объеме.

Основные радионуклиды чернобыльского выброса – 137Cs и 90Sr – включились в биологический круговорот веществ в лесных экосистемах, происходит их накопление лесной биотой и дальнейшая миграция по пищевым цепочкам. Загрязнение лесных почв 137Cs обусловило поступление радионуклида в древесные породы, другие виды лесной растительности, и величина мощности дозы гаммаизлучения на территории лесного фонда в десятки раз превышает доаварийный уровень.

Опыт ведения лесного хозяйства на территориях радиоактивного загрязнения показал, что в лесах, независимо от уровней загрязнения, не может полностью прекращаться лесохозяйственная деятельность. В зонах отселения необходимо постоянно осуществлять охраннорежимные функции в целях предотвращения несанкционированного доступа населения и пользования лесным фондом. В связи с отселением населенных пунктов, ограничениями использования лесов в зонах отселения на протяжении длительного времени на этих территориях частично или полностью нарушена лесная инфраструктура.

Площадь зон с контрольным режимом по Гомельской области на 1 мая 2014 г. составляла 373,4 тыс. га, в том числе зон отселения без Полесского

106

государственного радиационно-экологического заповедника (ПГРЭЗ) – 157,4 тыс. га, а по Могилевской области (ПГРЭЗ) – 98,9 тыс. га. Площадь лесных угодий, находящихся в ведении Министерства лесного хозяйства Республики Беларусь, в зонах отселения в Гомельской области составляет 126,8 тыс. га, в Могилевской – 79,1 тыс. га.

В зонах отселения в состав земель лесного фонда входят и высокозагрязненные сельскохозяйственные земли, выведенные из оборота и переданные под облесение. На 5511 га этих земель созданы преимущественно лесные культуры сосны. Состояние культур нуждается в дополнительной оценке.

Границы зон отселения периодически пересматриваются с учетом радиационной обстановки на загрязненных территориях и изменения их загрязнения вследствие распада радиоактивных элементов с течением времени.

Анализируя соотношение загрязненных радионуклидами лесов Министерства лесного хозяйства с плотностью загрязнения 137Cs свыше 15 Ки/км2 в Гомельской и Могилевской областях и лесов, относящихся к зонам отселения в этих областях, как отмечалось выше, можно увидеть,

что в состав зон отселения в настоящее время входят и леса, имеющие загрязнение 137Cs менее 15 Ки/км2, но загрязнение 90Sr более 0,1 Ки/км2.

За прошедший после аварии период, когда ведение лесохозяйственной деятельности было строго ограничено, произошли существенные изменения в состоянии лесных насаждений. В насаждениях, особенно сосновых и еловых, в ряде случаев захламленность достигает

100–150 м3/га.

В лесах зон отселения сформировались очаги вредителей и болезней. Так, в сосновых лесах зоны отселения Наровлянского района (вне Полесского государственного радиационно-экологического заповедника) на значительных площадях отмечен лубоед, в еловых лесах зоны отселения Ветковского, Чечерского, Кормянского, Добрушского районов идут процессы масштабного усыхания древостоев от повреждения коро- едом-типографом; в дубравах зон отселения Ветковского и Добрушского районов действуют очаги пядениц (зимней, обдирало, осенней).

Значительные площади лесных земель (свыше 23000 га) в зонах отселения Гомельской и Могилевской областей страдают от нарушений гидрологического режима из-за воздействий антропогенного характера и деятельности бобров, идут процессы интенсивного разрушения мелиоративных систем и гибели лесных насаждений, а процессы зарас-

107

тания полей сорняками способствуют накоплению больших объемов горючих материалов.

Все эти негативные процессы сказываются на противопожарном и санитарном состоянии насаждений в зонах отселения. Ограничения в хозяйственной деятельности за послеаварийный период привели к полной деградации лесной дорожной и квартальной сети (кроме дорог общего пользования) вследствие захламления, заколоженности, зарастания. Если густота лесной дорожной сети в лесах с нормальной хозяйственной деятельностью в Беларуси составляет в настоящее время 1,81 км на 100 га, то в зонах отселения она фактически на порядок ниже. Тем самым ограничивается доступ транспорта и доставка специальных средств в леса зон отселения в случае пожаров и стихийных бедствий.

При этом в лесах зон отселения в большинстве случаев не выполняются требования противопожарного обустройства.

Информация о состоянии, составе, структуре лесов с высокими (свыше 15 Ки/км2) уровнями загрязнения до настоящего времени отдельно не выделялась. Отдельный учет лесов по этим зонам не ведется. В последний раз такой учет был выполнен в 1994 г.

При выполнении работ по Программе совместной деятельности по преодолению последствий чернобыльской катастрофы в рамках Союзного государства на период до 2016 года по подготовке аналитических данных для концепции управления зонами отселения и отчуждения нами проведено изучение структуры лесных земель и породного состава лесов с загрязнением свыше 15 Ки/км2 в лесхозах Гомельской и Могилевской областей, имеющих эти зоны.

Как видно из табл. 1, в разрезе возрастных категорий покрытые лесом земли распределены следующим образом: преобладают в целом средневозрастные насаждения – 42,6 %, доля молодняков составляет 26,2 %, спелых и перестойных – 14,0 %.

В 1994 г. структура лесов в зоне свыше 15 Ки/км2 была следующей: молодняки – 47,3 %, средневозрастные – 39,6 %, приспевающие – 10,6 %, спелые – 2,5 %. Таким образом, за 20 лет возрастная структура изменилась существенно: доля спелых лесов возросла в 5,6 раза, приспевающих – в 1,6 раза. Изменение возрастной структуры в целом определено рядом причин: передачей лесов в ПГРЭЗ после 1993 г., уменьшением загрязнения ряда участков вследствие распада 137Cs и переходом их в зону 5–15 Ки/км2, старением лесов и др.

108

Та б л и ц а 1. Возрастная структура лесов Гомельской и Могилевской областей

взонах отселения (свыше 15 Ки/км2)

С учетом различий в накоплении радионуклидов разными древесными породами особый интерес с точки зрения возможной эксплуатации лесов представляет их распределение по породному составу. Как видно из табл. 2, вследствие указанных выше причин площадь хвойных и твердолиственных насаждений по сравнению с 1984 г. значительно сократилась, а доля мягколиственных возросла, прежде всего за счет естественного облесения переданных в лесной фонд высокозагрязненных сельскохозяйственных земель.

Та б л и ц а 2. Породный состав лесов Гомельской и Могилевской областей

взоне свыше 15 Ки/км2

При этом количество спелых и перестойных хвойных насаждений составляет 30 %, твердолиственных – 27,3 %, мягколиственных – 33,1 %, т. е. больше, чем в 1994 г.: хвойных – в 1,8 раза, мягколиственных – в 3,9 раза.

Внастоящее время продолжаются работы по изучению других аспектов лесоводства в зонах отселения: оценивается санитарное состояние лесов, состояние лесных культур, противопожарное обустройство лесов, состояние мелиорированных лесных земель.

Взаключение следует отметить, что по мере изменения радиационной обстановки и уменьшения плотности загрязнения почв, мощности дозы гамма-излучения, содержания радионуклидов в лесной продукции будут сняты ограничения по радиационному фактору и поэтапно будет осуществляться возврат к нормальным условиям ведения лесного хозяйства в зонах отселения, а полученные аналитические данные послужат базой не только для стратегического управления зонами отселения, но и основой ведения хозяйственной деятельности на этих территориях, их реабилитации.

УДК 633.34:546.36

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ СОИ В УСЛОВИЯХ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ

Г. З. ГУЦЕВА, канд. с.-х. наук ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси»

г. Гомель, Республика Беларусь

В результате последствий чернобыльской катастрофы в Беларуси сельскохозяйственное производство ведется на загрязненных 137Cs с плотностью более 37 кБк/м2 (1 Ки/км2) и 90Sr с плотностью выше 5,55 кБк/м2 (0,15 Ки/км2) почвах. Особую сложность представляет

производство нормативно чистой продукции на сельскохозяйственных угодьях с содержанием 137Cs 185–1480 кБк/м2 (5–40 Ки/км2) и одно-

временным загрязнением 90Sr с плотностью 11,1–111 кБк/м2 (0,3– 3,0 Ки/км2) 1 . В первую очередь это относится к высокобелковым бобовым культурам, которые в процессе роста и развития способны накапливать большее количество радионуклидов. По этой причине в первые годы после аварии была резко сокращена доля бобовых в структуре посевных площадей сельхозпредприятий, расположенных

110