2015Сибирский НИИ сыроделия, сборник научных трудов

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение

Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия

Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока

СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ с международным участием

Выпуск 12

Барнаул 2015

1

СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ с международным участием Федерального государственного бюджетного научного учреждения Сибирский научноисследовательский институт сыроделия

А437 Актуальные проблемы техники и технологии переработки моло-

ка: сборник научных трудов с международным участием; вып. 12 / под ред. А.А. Майорова. – Барнаул : АЗБУКА, 2015. – 184 с.

ISBN

Главный редактор – д.т.н., проф. Майоров А.А.

Ответственный секретарь – к.т.н., доц. Мусина О.Н.

Члены редколлегии:

-к.т.н. Ткаченко В.В.

-к.т.н. Белов А.Н.

-к.т.н. Мироненко И.М.

-к.б.н. Иркитова А.Н.

-Желнов М.В.

2

3

4

5

6

НАУЧНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МОЛОЧНОЙ ОТРАСЛИ

УДК 637.1: 613.2

Актуальные аспекты проблемы бактериофагии в сыроделии

Н.И. Одегов, Р.В. Дорофеев, В.В. Ткаченко

ФГБНУ «Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия», г. Барнаул

Процесс производства сыра можно рассматривать как систему биотехнологических операций, обеспечивающих возможность концентрирования ингридиентов молока и/или их биотрансформации в легко усваиваемые компоненты.

Микробиологической основой любой технологии в сыроделии является молочнокислый процесс. Главной его составляющей является сбраживание лактозы молочнокислыми бактериями (МКБ), в преимущественно заквасочной этиологии, с образованием молочной кислоты (гликолиз) [1]. Кроме того, мультиэнзимный комплекс, образующийся в результате деятельности МКБ, предопределяет также процессы биодеструкции других основных компонентов сырной массы.

Многолетняя практика сыроделия показывает, что наиболее распространенным ингибирующим фактором, приводящим к снижению активности микрофлоры заквасок, в 80-90% случаев является фаголизис составляющих её бактериальных клеток [2, 3, 4].

Установлено, что бактерии практически каждого из известных видов, в том числе и МКБ, являются хозяином одного или нескольких штаммов бактериофагов [5].

Таким образом, важнейшей задачей биотехнологии производства качественных ферментированных молочных продуктов (в первую очередь сыра) в настоящее время является обеспечение оптимального хода микробиологических процессов.

Естественно, что система учета фаговой опасности для любых ферментационных процессов базируется на особенностях биологии бактериофагов (параметры адсорбции, длительность латентного периода, выход корпускул и др.). Известно, что латентный период и выход фагочастиц для различных систем «фаг-хозяин» колеблется в значительных пределах. Например, для фагов мезофильных лактококков эти величины равняются 25-150 мин и 40-300 фагочастицам, соответственно [6, 7].

Установлено, что на сыродельных предприятиях распространены фаги, активные в отношении практически всех видов молочнокислых бактерий (мезофильных и термофильных лактококков, термофильных стрептококков и термофильных палочек) [8, 9, 10]. Спектр литической активности бактериофагов детерминируется геномом фага, наличием клеток бактериальных хозяев, гетерогенностью их клеточных популяций и географической локализацией предприятий. В частности, результаты исследований литической активности фагов на

7

предприятиях Алтайского края показали приоритет распространенности фагов, лизирующих клетки Lactococcus lactis subsp. lactis и меньшую распространен-

ность фагов, лизирующих культуры Lactococcus lactis subsp. cremoris или Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis по сравнению с европейской частью страны [11].

Естественно, что в природе существует определённое внутривидовое и межвидовое соотношение между фагоустойчивыми и фагочувствительными штаммами различных систематических групп микроорганизмов. Такое соотношение характеризует естественное динамическое равновесие в системе фагхозяин, управляемое едиными для всех микроорганизмов законами, сложившимися в результате их эволюции. Причем, термин «фагоустойчивый» говорит лишь о более или менее высокой устойчивости данного штамма к специфическим фагам, наиболее распространенным в данный период в той или иной географической зоне и имеющимся в распоряжении исследователя.

Многие способы борьбы с фаговой опасностью в молочной промышленности основаны на использовании различных физических и химических факторов, влияющих на репродукцию бактериофагов (температура, активная кислотность, ионный состав среды размножения, перекисные соединения, излучения и др.).

Применяемые в сыроделии режимы пастеризации молока не обеспечивают гарантированной инактивации всех бактериофагов молочнокислых бактерий. Термизация до 65-70оС несколько ослабляет развитие бактериофагов, но их полное уничтожение наступает после 3-10 минутной выдержки молока при 9095оС [12, 13]. Термоинактивация бактериофагов определяется денатурацией фагового белка [9, 14, 15].

На репродукцию бактериофага величина активной кислотности среды оказывает незначительное влияние. Установлены широкие пределы значений pH (от 3,5 до 10,0), при которых фаги способны вызвать лизис мезофильных лактококков; по данным работ [12] полностью фаги погибали лишь при pH 2,5, а по данным [15] - при рН 0 и рН 11,0.

Таким образом, бактериофаги молочнокислых бактерий обладают высокой кислото- и щелочеустойчивостью и могут репродуцироваться практически на всех стадиях выработки и созревания сыров.

Взаимодействие фагов с клеткой-хозяином представляет собой сложный динамический процесс. На параметры этого процесса оказывают влияние множество факторов, которые на практике используются в системе мер повышения фагоустойчивости бактериальных заквасок в сыроделии.

Известно, что основными источниками фагов, попадающих в молочную смесь для выработки сыра, являются сырое молоко, поверхности трубопроводов и оборудования, а также закваска, которая контаминирована фагами ранее [16]. Главная же роль в заражении предприятия бактериофагами принадлежит подсырной сыворотке, являющейся благоприятной средой для их репродукции, способствующей сохранению данного набора фагов, а также появлению их мутантов и фенотипических модификаций [9, 10, 11, 15].

Возможным источником бактериофагов на заводе могут быть лизогенные культуры заквасок, которые при воздействии индуцирующими факторами (гра-

8

диент физических и химических факторов среды.) могут продуцировать варианты бактериофагов, вирулентных к соседним штаммам закваски [28, 29].

В основе методов предотвращения фаголизиса заквасочных культур в сыроделии лежат два принципа: полное устранение заражения бактериофагами заквасок и смеси для выработки сыра и обеспечение нормального развития заквасочной микрофлоры в присутствии бактериофагов.

Выражением первого направления явилось создание заквасочных емкостей, аппаратов и узлов различных конструкций, позволяющих создавать асептические условия проведения операций производства заквасок, исключающие попадание нестерильного воздуха в резервуар, а значит и возможность заражения этим путем производственной закваски посторонними микроорганизмами, в том числе и фагами.

Большинство «противофаговых» мер, используемых в настоящее время, базируется на идее обеспечения нормального течения микробиологических процессов при выработке сыра в присутствии бактериофагов (второе направление) [2, 19]. Эти способы основаны на использовании различных факторов, влияющих на цикл воспроизводства фаговых вирионов и обеспечивающих минимальную возможность фаговой атаки заквасочной микрофлоры имеющимися в среде бактериофагами.

Значительное место в арсенале методов борьбы с бактериофагами в сыроделии отводится использованию концентрированных бактериальных препаратов и заквасок для беспересадочного способа приготовления производственной закваски или для «прямого внесения» в сырную ванну [2]. Эти способы высокоэффективны и позволяют снизить до минимума вероятность заражения закваски посторонней микрофлорой и бактериофагами.

Приведенные меры борьбы с бактериофагами позволяют в той или иной мере обезопасить культуры бактериальных заквасок от фаголизиса, но лишь до момента внесения их в ванну. Присутствие же бактериофагов в пастеризованном молоке, предназначенном для выработки сыра, практически неизбежно, поскольку детерминировано наличием «вирусной» эволюционной ниши.

Поэтому, в практике отечественного сыроделия для снижения вероятности инактивации закваски под действием бактериофагов при выработке сыра в ее состав вводят по несколько штаммов молочнокислых бактерий одного и того же вида, кроме того весь штаммовый состав закваски периодически меняют

В настоящее время сформулированы следующие «антифаговые» принципы подбора производственных штаммов в состав бактериальных заквасок для сыров:

-штаммы, входящие в состав заквасок должны быть устойчивы к коллекционным фагам или могут быть чувствительны к возможно наименьшему их количеству и различаться по фаготипу (набору фагов, лизирующих данную культуру);

-в последнем случае приоритет отдается культурам лишь с определенными характеристиками литического цикла системы фаг-хозяин (наименьшие скорость адсорбции, и выход вирионов, наибольшая длительность латентного периода);

9

-штаммы соседствующих по времени использования партий заквасок должны отличаться по фаготипу;

-лизогенные или обладающие антагонистической активностью культуры не должны использоваться в составе заквасок [2, 8, 19].

Дальнейшее повышение действенности приведенного механизма защиты заквасочных культур от фаголизиса лежит на путях повышения фагорезистентности самих бактериальных штаммов.

Следует отметить, что все рассмотренные выше способы предотвращения фаголизиса бактериальных заквасок в сыроделии естественно предполагают тестирование производственных культур, включаемых в состав бактериальных препаратов, на фагоустойчивость. Такое тестирование проводится в соответствующих лабораториях предприятий, производящих бакпрепараты.

Однако, выраженная степень консерватизма таких коллекций, отражающих ранее сложившиеся реалии фаговой обстановки, а также высокая генетическая изменчивость бактериофагов, их способность «захватывать» при репродукции на заквасочных культурах часть генома клетки-хозяина и наличие определенного мутагенного фона приводят к тому, что бактериофаги довольно быстро могут менять свою вирулентность. Это приводит, в свою очередь, к накоплению на производстве высоковирулентных штаммов фагов с широким спектром литического действия.

Поэтому заквасочные культуры, в своё время отобранные, как «фагорезистентные», могут лизироваться фагами, причем возможный интервал времени, необходимый для смены такой «фаговой» полярности на противоположную, может оказаться достаточно коротким, и партия бакпрепарата, обеспечивающая поначалу, высокую активность бактериальной закваски может утратить эту способность задолго до планируемой ротации (смены) партии препарата.

Исправить это положение возможно лишь путем налаживания оперативной обратной связи «производство сыра – производство бакпрепарата».

В идеале это выглядит как комплекс работ по фагомониторингу молочных предприятий, постоянному выявлению на них новых разновидностей фагов и введению их в состав селективного фагового набора (коллекций), используемого при отборе производственных штаммов по признаку «фагоустойчивость» на предприятиях - производителях бактериальных препаратов.

Резюмируя вышеизложенное, можно отметить, что специфика биотехнологии сыроделия (нестерильное сырье, контакт продукта с внешней средой, длительность процесса выработки сыра, многократность циклов выработки и др.) и эволюционно-генетические детерминанты микромира (высокая генетическая изменчивость бактерий и вирусов, особенности динамики взаимодействия составляющих системы «фаг-бактериальный хозяин», значительная вероятность лизогенизации производственных штаммов, используемых в составе заквасок и др.) диктуют необходимость постоянного совершенствования существующих и разработку новых мер борьбы с фаголизисом в сыроделии, обеспечивающих нормальное течение микробиологических процессов в условиях перманентной фаговой инфекции.

10