2015Сибирский НИИ сыроделия, сборник научных трудов

Количественный и качественный состав низкомолекулярных компонентов, с ММ <17 кДа, изменяется в меньшей степени. Качественный состав остается неизменным – всё те же 5 минорных полипептидов. Относительное содержание полипептидов с ММ <17 кДа уменьшается примерно на 18% (с 23,6% до

20,0%).

Снижение относительного содержания белков сММ ~32-42 кДа и ММ <17 кДа приводит к увеличению относительного содержания основного полипептида с ММ ~17 кДа примерно на 10% (с 71,7% до 78,7%)

Наблюдаемые, в процессе длительного хранения, изменения количественного и качественного состава препарата ГП-СибНИИС не сопровождаются значимыми изменениями в его специфической активности. Молокосвертывающая активность опытного образца жидкого препарата ГП-СибНИИС, после 7 месяцев хранения при 5-100 С, равнялась 2556 УЕ/мл (стартовое значение – 2577 УЕ/мл). Снижение МА опытного препарата составило примерно 0,8%, что намного меньше ошибки метода определения МА (±5%). Для жидких МФП допустимым считается снижение МА на 5% за 6 месяцев хранения при температуре 5-100С. Таким образом, МА опытного препарата ГП-СибНИИС в течение всего срока хранения снижается менее чем на 1%.

Исследование протеолитической специфичности. В основе действия любого молокосвертывающего фермента лежит его протеолитическая активность. Различают два типа протеолитической активности МФ [9]. Специфическую или молокосвертывающую активность (- способность гидролизовать одну ключевую связь в молекуле κ-казеина (Phe105-Met106), что приводит к дестабилизации казеиновых мицелл и инициирует образование молочного сгустка. Неспецифическую протеолитическую активность (НПА) - способность молокосвертывающего фермента гидролизовать любые пептидные связи в белках молока, по отношению к которым фермент специфичен, кроме связи Phe105Met106. Высокая НПА, способна вызывать глубокую гидролитическую деградацию казеинов, что приводит к целому ряду негативных последствий в сыроделии: (1) изменяются физико-химические свойства казеиновых мицелл (например, Са-связывающая способность) и молочного сгустка и, как следствие, параметры обработки сырного зерна; (2) увеличиваются потери белка и жира с подсырной сывороткой, соответственно, снижается выход сыра; (3) возникает опасность накопления в сыре горьких пептидов (особенно при длительных сроках созревания и хранения), что приводит к появлению пороков вкуса;

(4) формируются пороки консистенции сыра (несвязная, мажущаяся). Идеальный МФП должен, при максимальной молокосвертывающей актив-

ности, иметь минимальную неспецифическую протеолитическую активность. В наибольшей степени этому требованию отвечает химозин коровы, считающийся эталоном молокосвертывающего фермента. Гомогенный натуральный химозин не используется в промышленности из-за высокой стоимости. Вместо него применяют частично очищенный экстракт слизистой оболочки сычуга теленка коровы, который называется сычужным ферментом (СФ) и содержит два коагуляционно активных компонента - химозин и пепсин. В высококачественном телячьем СФ на долю химозина приходится до 96% молокосвертывающей активности.

121

Дефицит СФ заставил начать поиски молокосвертывающих протеиназ, способных стать его заменителями. Одним из основных критериев пригодности МФ для сыроделия стала низкая НПА. Из огромного перечня природных ферментов, способных коагулировать молоко, наиболее широко в сыроделии используются коровий и свиной пепсины, протеиназы микроскопических грибов Mucor pusillus и M. miehei – мукорпепсины [10,11]. С конца прошлого века для выработки сыра стали применять препараты рекомбинантного химозина (рХН) коровы, получаемые методами генной инженерии с использованием генетически модифицированных микроорганизмов [9,12].

По нашим данным [13], говяжий пепсин по уровню НПА уступает только СФ и препаратам рХН. Удельная НПА говяжьего пепсина выше, чем у СФ и рекомбинантного химозина В, в 1,55 и 2,47 раза, соответственно. В чистом виде область применения ГП такая же, как у мукорпепсинов - производстве обезжиренных (для плавления) и рассольных сыров, а также сыров с чеддаризацией и термомеханической обработкой. Но в отличие от них, в составе комплексных МФП (в случаях, когда его содержание не превышает 50%), ГП может использоваться для производства сыров голландской группы с низкой температурой второго нагревания, мягких сыров и, формуемых насыпью сыров с низкой температурой второго нагревания и высоким уровнем молочнокислого процесса.

В данном исследовании в качестве критериев оценки протеолитической специфичности выбраны: (1) изменение относительного содержания α- и β- казеинов, что характеризует неспецифическикую протеолитическую активность; (2) изменение относительного содержания полипептидных компонентов (низкомолекулярных продуктов гидролиза казеинов) с молекулярными массами <28 кДа - зависит от специфической (молокосвертывающей) активности и от уровня неспецифического протеолиза (общей протеолитической активности).

Изменения, происходящие после внесения в субстрат препаратов го-

вяжьего пепсина. При исследовании протеолитической активности и специфичности, в качестве контроля использовали препарат казеина по Гаммерстену, без внесенного в него молокосвертывающего фермента (нулевой контроль). На Рисунке 1 представлены образцы субстрата (трек № 3) и фермент-субстратной смеси, сразу после внесения в неё препаратов ГП-МЗСФ (трек №2) и ГПСибНИИС (трек №4). Видно, что уже в момент внесения в субстрат препаратов ГП, κ-казеин субстрата подвергается интенсивной протеолитической атаке, в результате которой на электрофореграмме образцов, обозначенных как "0 минут инкубации", появляется компонент с ММ ~16 кДа. – пара-к-казеин. При этом относительное содержание полосы к-казеина – уменьшается примерно вдвое. Если в нулевом контроле относительное содержание κ-казеина составляет 9,7%, то после внесения ГП-МЗСФ и ГП СибНИИС, относительное содержание этой фракции, снижается, соответственно, до 5,0% и 4,1%. Наблюдаемая картина является отражением первой стадии свертывания молока (ферментативный гидролиз), в результате которой происходит разрыв ключевой пептидной связи Phe(105) - Met(106) в молекуле κ-казеина и образование 2 продуктов гидролиза – пара-к-казеина (фрагмент 1-105), маркерного компонента с ММ ~16 кДа и казеинмакропептида (фрагмент 106-169) с ММ <10 кДа. [14-17]. Отметим, что при данных условиях проведения ЭФ-ДСН (разделяющий ПААГ

122

имеет концентрацию Т=12,5%, С=2,7%), казеинмакропептид мигрирует вместе с полипептидными компонентами, имеющими ММ <10 кДа, поэтому выделить фрагмент 106-169 в виде отдельной полосы – невозможно.

Исследование протеолитической специфичности свежеприготовленного опытного образца говяжьего пепсина.

Результаты денситометрического исследования электрофореграмм ФСС с опытным препаратом ГП-СибНИИС на старте (0 минут) (трек №4 на Рис. 1) и после 180 минут (трек №5 на Рис. 1) инкубации при 350С, представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Относительное содержание (%) полипептидных компонентов ферментсубстратной смеси с ГП-СибНИИС после 0 и 180 минут инкубации при 350С.

Гидролитической атаке опытного образца ГП-СибНИИС подвергаются в первую очередь κ- и α-казеины. После трех часов инкубации ФСС с ГПСИБНИИС относительное содержание α-казеинов снижается на 64,2%, фракция к-казеинов не детектируется. Бэтта-казеины субстрата устойчивы к действию опытного препарата жидкого ГП. По окончании инкубации относительное содержание β-казеинов в фермент-субстратной смеси снижается лишь на 2,9% и составляет 97,1% от исходного значения. Относительное содержание продуктов гидролиза казеинов – полипептидов с ММ <28 кДа увеличивается примерно в 1,9 раза, по сравнению со стартовым значением.

Результаты исследования протеолитической специфичности контрольного сухого препарат ГП-МЗСФ на старте (0 минут) (трек №2 на Рис. 1) и после 180 минут (трек №1 на Рис. 1) инкубации при 350С, представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Относительное содержание (%) полипептидных компонентов фер- мент-субстратной смеси с препаратом ГП-МЗСФ после 0 и 180 минут инкубации при 350С.

В отличие от опытного образца, контрольный коммерческий препарат ГП вызывает более глубокий протеолиз казеинов. В результате 3-х часовой инкубации субстрата с препаратом ГП-МЗСФ относительное содержание α-казеинов

123

в фермент-субстратной смеси снижается на 71,9%, что превышает аналогичный показатель для ГП-СибНИИС, примерно, на 12%. В случае использования контрольного препарата ГП-МЗСФ, наблюдается более интенсивный протеолиз β- казеинов – относительное содержание которых снижается на 15,9%. Таким образом, ГП-МЗСФ гидролизует β-казеины в 5,48 раза интенсивнее, чем опытный препарат ГП-СибНИИС. Интенсивный протеолиз α- и β-казеинов препаратом ГП-МЗСФ приводит к накоплению в фермент-субстратной смеси низкомолекулярных продуктов. Относительное содержание полипептидов с молекулярными массами <28 кДа, в случае использования ГП-МЗСФ, возрастает в 1,9 раза.

Таким образом, свежеприготовленный опытный образец (ГП-СибНИИС) превосходит коммерческий препарат натурального говяжьего пепсина (ГПМЗСФ) по такому параметру как минимальная интенсивность неспецифического протеолиза по отношению к α- и β-казеинам.

Исследование протеолитической специфичности опытного образца, хранившегося 7 месяцев при температуре 5-100 С.

Для того чтобы определить, меняется ли протеолитическая специфичность жидкого опытного препарата говяжьего пепсина в результате длительного хранения (и, если меняется, то как?) нами проведено повторное исследование протеолитической активности препарата ГП-СибНИИС, после 7 месяцев хранения при температуре 5-100 С. Результаты исследования представлены в Таблице 3.

Сравнив данные, представленные в Таблицах 1 и 3, можно сделать вывод о том, что длительное хранение опытного жидкого препарата ГП-СибНИИС не изменяет характер специфичности и лишь незначительно изменяет его протеолитическую активность. Как и до начала хранения, после к-казеина, препарат в первую очередь вызывает протеолиз α-казеинов. Однако, степень гидролиза α- казеинов почти не меняется: для свежеприготовленного и хранившегося препаратов, относительное содержание белков этой фракции, после 3-х часовой инкубации фермент-субстратной смеси, снижается, соответственно, на 64,2% и 65,8%. Бэтта-казеины по-прежнему проявляют высокую устойчивость к протеолитическому действию ГП-СибНИИС.

Таблица 3. Относительное содержание (%) полипептидных компонентов фер-

мент-субстратной смеси с ГП-СибНИИС, после 0 и 180 минут инкубации при

350С

Как и в начале исследования, в результате инкубации ферментсубстратной смеси относительное содержание β-казеинов, претерпевает минимальные изменения: для свежеприготовленного препарата снижение относи-

124

тельного содержания β-фракции составило 2,9%, а для препарата, хранившегося 7 месяцев при температуре 5-100 С – 3,3%. Относительное содержание низкомолекулярных продуктов (с ММ <28 кДа), увеличивается, для свежеприготовленного препарата, в 1,9 раза, для хранившегося – в 2,1 раза.

Параллельно с ГП-СибНИИС был исследован и контрольный препарат ГПМЗСФ, также хранившийся в сухом виде при температуре 5-100 С в течение 7 месяцев. Результаты его исследования представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Относительное содержание (%) полипептидных компонентов фер- мент-субстратной смеси с препаратом ГП-МЗСФ после 0 и 180 минут инкубации при 350С

Основные параметры протеолитической специфичности и протеолитической активности препарата ГП-МЗСФ за время хранения не претерпели значимых изменений (сравните данные Таблиц 4 и 2). Уровень протеолитической деградации α-казеинов "подрос" и составил 68,7% (против 71,9% в начале исследования), степень гидролиза β-казеинов, напротив, несколько уменьшилась и составила 15,.2% (против 15,9% в начале исследования). Относительное содержание полипептидов с ММ <28 кДа выросло в 1,13 раза – с ~189% в начале исследования, до ~215% через 7 месяцев хранения.

Сравнивая результаты исследования протеолитической активности опытного и контрольного препаратов ГП (Таблицы 3 и 4) видно, что и через 7 месяцев хранения, неспецифическая протеолитическая активность ГП-МЗСФ, в целом, выше чем у ГП-СибНИИС, а способность ГП-МЗСФ более интенсивно гидролизовать β-казеины – сохраняется.

Выводы по результатам исследования полипептидного состава.

1.Экспериментальный образец жидкого ГП содержит основной полипептидный компонент, с ММ ~17 кДа, характерный для коммерческих препаратов натурального говяжьего пепсина.

2.Контрольный и экспериментальный препараты имеют похожий, но не идентичный количественный и качественный состав, что, вероятно, объясняется различиями в технологии их производства.

3.Хранение при температуре 5-100С в течение 7 месяцев приводит к незначительным изменениям количественного и качественного полипептидного состава жидкого препарата говяжьего пепсина и не влияет на его специфическую (молокосвертывающую) активность.

Выводы по результатам исследования протеолитической специфичности.

125

1.Экспериментальный образец жидкого говяжьего пепсина проявляет высокую специфичность по отношению к κ-казеину, среднюю специфичность по отношению к α-казеинам и низкую специфичность по отношению к β-казеинам.

2.По сравнению с контрольным коммерческим препаратом, экспериментальный жидкий препарат говяжьего пепсина характеризуется меньшей неспецифической протеолитической активностью по отношению к β-казеинам.

3.Протеолитическая специфичность жидкого говяжьего пепсина не изменяется в результате длительного хранения (7 месяцев при 5-100 С).

Список литературы

1.Ельчанинов, В.В. Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 1. Влияние рН и объема экстрагента на выход ферментативной активности / В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль, А.В. Кригер, Н.В. Овчарова, А.Н. Белов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Бар-

наул, 2011.- С.128-134.

2.Ельчанинов, В.В. Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 2. Влияние температуры и концентрации хлористого кальция на выход ферментативной активности / В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль, А.В. Кригер, Н.В. Овчарова, А.Н. Белов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2011.- С. 134-139.

3.Ельчанинов, В.В. Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 4. Влияние рН, природы буферных компонентов и пищевых консервантов на активность растворов пепсина при длительном хранении / В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль, А.В. Кригер, А.Н. Белов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул, 2012.- С. 185-192.

4.108. Ельчанинов, В.В. Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 5. Исследование технологических свойств жидких препаратов говяжьего пепсина (подчинение закону ШторкаЗегелке и протеолитическая активность) / В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль, А.В. Кригер, А.Н. Белов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием. - Барнаул,

2013.- С. 179-184.

5.Ельчанинов, В.В. Разработка технологии производства молокосвертывающего препарата для сыроделия. 6. Исследование технологических свойств жидких препаратов говяжьего пепсина (термостабильность, влияние рН и кон-

центрации CaCl2 на молокосвертывающую активность) / В.В. Ельчанинов, А.Д. Коваль, А.В. Кригер, А.Н. Белов // Современные проблемы техники и технологии переработки молока: сборник научных трудов с международным участием.

-Барнаул, 2014.- С. 93-99.

6.Ельчанинов, В.В. Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, М.С. Уманский, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.Г. Шелепов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- №4.- С.13-16.

126

7.Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K.Laemmli / Nature.- 1970.- V 227.- P. 680-685.

8.Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А.Остерман.- М.: Наука, 1981.- ч.1.- 168 с.

9.Мурунова, Г.В. Принципы подбора молокосвертывающего фермента для производства сыра. / Г.В. Мурунова, Ю.Я. Свириденко // Сыроделие и маслоделие. 2006.- № 5.- С. 2-5.

10.Phelan, J.A. Milk Coagulants – An Evaluation of Alternatives to Standard Calf Rennet/J.A.Phelan // Phd Thesis.- 1985.- National University of Ireland, Cork.

11.van den Berg, G. Fermentation produced chymosin: technological aspect of its use for cheesemaking./ G. van den Berg // Int. Dairy Federation.- 1992.- Bulletin 219.- P. 13-17.

12.Flamm, E.L., How FDA approved chymosin: a case history / E.L. Flamm // Bio/Technology.- 1991.- V 9.- P. 349-351.

13.Ельчанинов, В.В. Исследование и сравнительный анализ протеолитической активности молокосвертывающих препаратов. / В.В. Ельчанинов // Современные проблемы техники и технологии пищевых производств: труды 11-й международной научно-практической конференции (Барнаул, 5 декабря 2008 г.).- Барнаул.- 2008.- С. 243-247.

14.Краюшкин, В.А. К вопросу о моделировании сычужного свертывания молока / В.А.Краюшкин, Ю.Я.Свириденко, Г.В.Мурунова, В.Н. Краюшкина, В.В.Смирнов // Сыроделие и маслоделие. - 2004 - № 5 - С. 39-42.

15.Dalgleish, D.G. The enzymatic coagulation of milk. In Cheese: Chemistry, Physics and Microbiology / D.G. Dalgleish.- P.P. Fox ed.- 2 ed.- Aspen Publishers, Gaithersburg, MD.- 1993.- Vol. 1.- General Aspects.- P. 69-100.

16.Fox, P. F. Proteolysis during cheese manufacture and ripening / P.F. Fox // J. Dairy Sci.- 1989.- N 72.- P.1379–1400.л1-46, р3.5-10.

17.Grappin, R. Primary proteolysis of cheese proteins during ripening. A review / R. Grappin, T.C. Rank, N.F. Olson // J. Dairy Sci.- 1985.- N 68.- P. 531–540.

УДК 637.3:632.952

Производство сыров с высокой температурой второго нагревания на основе использования комплексов ферментных препаратов

А.В. Кригер, к.т.н., доцент, ст. научный сотрудник, А.Н. Белов, к.т.н., ст. научный сотрудник, зав. лабораторией

ФГБНУ «Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия», Барнаул

Проблема сокращения продолжительности процесса созревания сыров является весьма актуальной уже многие годы. Её решение позволит получить продукт высокого качества, ускорить оборот денежных средств предприятия. Сокращение сроков созревания сыров тесно связано с интенсивностью и

127

направленностью ферментативных превращений сырной массы, в результате которых готовый продукт приобретает характерный для каждого вида вкус и запах [1, 3, 4, 6]. Работы по изучению молокосвёртывающих и липолитических ферментных препаратов очень важны для решения данной проблемы.

Один из путей регулирования процесса созревания сыров - подбор необходимого спектра ферментных препаратов. Применение при производстве сыров смесевых композиций с высоким содержанием пепсина, как показывает практика, не всегда положительно сказывается на выходе сыра, процессах созревания и его качестве при продолжительном хранении [5, 7, 8]. Поэтому для экспериментов были выбраны натуральные препараты сычужного фермента с высоким содержанием химозина, которые традиционно используются при выработке всех групп сыров. Наряду с говяжьим пепсином в составе комплекса ферментов, примененных нами при выработке сыра, были использованы натуральные препараты прегастральных липаз теленка и козлёнка для формирования органолептических показателей.

Были составлены экспериментальные варианты девяти смесевых композиций ферментных препаратов (таблица 1) с помощью многоуровневого ортогонального плана для четырёх факторов [2], где каждый фактор варьировал на трех уровнях.

В соответствии с разработанным планом проводили выработки сыра (таблица 2).

Таблица 1 – Схема экспериментов по многоуровневому плану

В качестве исходных ферментов были использованы препараты животного происхождения: сычужный фермент Calf rennet Clerici 96/4 и Calf rennet Clerici 70/30 и натуральные препараты прегастральных липаз телёнка Calf lipase и козлёнка Kid goad lipase, поставляемые итальянской фирмой «Caglificio Clerici SPA», Италия.

Сыры вырабатывали по технологии сыров с высокой температурой второго нагревания. Экспериментальные сыры дегустировали комиссионно в возрасте кондиционной зрелости. Хранение сыров осуществлялось при температуре от 2 до 4 0С и относительной влажности воздуха от 85 до 90 %.

128

В возрасте кондиционной зрелости и после четырёх месяцев хранения экспериментальные сыры подвергались дегустации. Дегустацию проводили комиссией в составе специалистов СибНИИ сыроделия.

Таблица 2 – Состав ферментных композиций для выработки сыров

При проведении предварительного анализа состава ферментных композиций на формирование качества сыра был использован план и результаты органолептической оценки сыров (таблица 3).

Таблица 3 – План выработок сыров

Посредством применения аддитивно-решётчатого математическогоописания объекта рассчитывали общий результат процесса, который определяли как сумму эффектов различных факторов (таблица 4), а именно: количества пепсина, химозина, липазы телят и липазы козлят, на формирование органолептических характеристик продукта.

129

Таблица 4 – Наименование и уровни факторов

Ортогональные схемы планирования позволили найти точечные оценки эффектов bik для всех уровней каждого фактора. Значение коэффициента bik ≥ 0 говорит о наибольшем положительном эффекте от применения того или иного фактора. Значение коэффициента bik ≤ 0 – об удовлетворительном воздействии фактора (Таблица 5).

Таблица 5 – Определение коэффициентов аддитивно-решётчатого описания

Судя по предварительным результатам моделирования, для сыров после созревания c увеличением в МФП доли пепсина возрастает общая органолептическая оценка сыра (таблица 4, 5).

Результаты проведения предварительного анализа состава ферментных композиций на формирование качества сыра после четырех месяцев хранения представлены в таблице 6.

130