Журнал неврологии и психиатрии / 2005 / NEV_2005_10_06

новления информации, хранящейся в памяти, и с другими когнитивными функциями мозга [29].

Снижение амплитуды и увеличение латентности Р300 (в первую очередь в слуховой модальности) и связь этих аномалий с психопатологическими характеристиками у больных шизофренией являются одним из самых устойчивых электрофизиологических феноменов данного заболевания [1, 7, 22, 25, 30]. В некоторых работах аналогичные изменения зарегистрированы также у части родственников больных [3, 5, 14]. Полученные результаты позволили высказать предположение, что изменения показателей Р300 можно рассматривать в качестве фактора предрасположения к шизофрении, хотя они и не относятся к ее специфическим проявлениям, так как встречаются и при других расстройствах.

Процессы, связанные с генерацией ВП, изучены пока недостаточно. Предполагается, что непосредственную роль в этих процессах играют нейротрансмиттерные системы. Однако работы, посвященные изучению связи активности нейрохимических систем и вовлеченных в их функционирование генов с показателями Р300, весьма немногочисленны. Наиболее часто упоминаемыми в литературе нейротрансмиттерами, имеющими отношение к генерации ВП, являются серотонин и дофамин. Соответственно влияние полиморфизма некоторых генов серотонинергической и дофаминергической систем на выраженность ВП и в том числе Р300 при различных психических расстройствах, а также у здоровых людей явилось предметом ряда исследований. Так, обнаружена ассоциация между полиморфными вариантами генов дофаминового рецептора DRD2 и фермента катехол- О-метилтрансферазы (СОМТ), который участвует в деградации дофамина, и компонентом Р300. Оказалось, что у лиц с наследственным предрасположением к алкоголизму [27]

èс наркоманией [6] аллель А1 гена DRD2 (полиморфизм Taq1A), рассматриваемый в качестве аллеля риска развития различных зависимостей, связан с большей латентностью Р300. Изучение связи между этим геном, Р300 и курением продемонстрировало, что лица с аллелем А1 имели более низкую амплитуду Р300 [4]. При исследовании больных депрессивным расстройством в китайской популяции с использованием двух полиморфных маркеров гена DRD2 (Taq1A

èинсерционно-делеционный полиморфизм -141С Ins/Del) не было найдено ассоциации ни с одним показателем Р300 [8]. Причиной отрицательного результата мог быть этниче- ский фактор, так как более ранние работы, указанные выше, были проведены у европейцев.

Âгене СОМТ для анализа ассоциаций с ВП использовали однонуклеотидный полимофизм, вызывающий замещение аминокислот (валин—метионин) (Val158Met) и имеющий функциональный характер, который выражен в 4-кратном изменении активности соответствующего фермента. В случае аллеля Val фермент имеет более высокую активность и разлагает дофамин более активно, тем самым снижая его количество, особенно в префронтальной коре. Некоторые исследования показали, что аллель Val ассоциирован с шизофренией [16, 33], а также с худшим выполнением нейрокогнитивных тестов, относящихся к вниманию и рабочей памяти, как у больных шизофренией и их родственников [38], так и у психически здоровых людей [24]. До сих пор были опубликованы две работы, в которых сделана попытка установить связь между полиморфизмом гена СОМТ

èР300. Так, S. Tsai и соавт. [36] измерили показатели Р300 у здоровых женщин китайской национальности с различными генотипами СОМТ и обнаружили, что у носительниц генотипа Met/Met среднее значение латентности было ниже, чем у женщин с генотипом Val/Val. В работе J. Gallinat и соавт. [15] установлено, что как у больных шизофренией, так и у психически здоровых людей амплитуда Р300 во фронтальной области ниже при наличии генотипа Met/Met по сравнению с генотипами, включающими аллель Val. Авторы объясняют эту связь тем, что Р300 в указанной области в определенной степени отражает уровень так называемого

нейронного «шума», возникающего в процессе обработки информации. Согласно их предположению, дофамин играет роль в регуляции этого шума и поэтому в случае аллеля Met, связанного с низкой активностью дофамина, количество последнего увеличивается, что оказывает положительное влияние на выполнение задачи.

О роли серотонина в генерации Р300 можно судить по косвенным литературным данным, например по изменению показателей этого компонента у больных при лечении ингибиторами обратного захвата серотонина или нейролептиками [9]. Лишь в одном исследовании [20] сообщается о связи между активностью рецепторов серотонина типа 1а и амплитудой Р300 у больных депрессией. Была также предпринята попытка изучения влияния полиморфизма гена серотонинового рецептора типа 2а (5-HTR2A), представленного однонуклеотидной заменой Т102С в экзоне 1, на изменение компонентов ВП при лечении клозапином больных шизофренией [39]. Оказалось, что такое влияние имеет место, но оно было обнаружено только для другого компонента ВП — N100. Имеются также сведения о влиянии полиморфизма гена переносчика серотонина (полиморфизм числа нуклеотидных повторов в области, примыкающей к промотору, — 5-HTTLPR) на электрическую активность мозга, отражающую реакцию на допущенную в процессе выполнения задачи ошибку у психически здоровых людей [12]. В этой работе у носителей аллеля, представленного меньшим числом этих повторов, регистрировалась более высокая амплитуда соответствующих волн.

Как следует из приведенных литературных данных, необходимо дальнейшее изучение вклада полиморфизма генов дофаминергической и серотонинергической систем в выраженность компонента Р300 у больных шизофренией и особенно у их родственников, у которых такие исследования до сих пор не проводились.

Целью настоящей работы было изучение влияния на латентность и амплитуду Р300 нескольких генов, в том числе упомянутых выше, в частности СОМТ, переносчика серотонина и 5-HTR2A, а также гена дофаминового рецептора DRD4. Полиморфизм последнего оценивали по однонуклеотидным заменам -809G/A, -616G/C и -521С/Т в области промотора. Основанием для включения этого гена в анализ ассоциаций послужили данные о его связи с нейрональными системами, определяющими функции внимания [13].

Материал и методы

Обследовали больных шизофренией и расстройствами шизофренического спектра, а также их родственников первой степени родства.

Критериями включения в исследование являлись отсутствие органических поражений ЦНС, жалоб на слух и злоупотребления алкоголем. Все испытуемые были правшами.

Выборка больных состояла из 74 человек — 38 мужчин и 36 женщин. Их средний возраст был 29,93±12,44 года, возраст к началу заболевания — 23,46±6,75 года.

Диагноз устанавливали на основании диагности- ческих критериев МКБ-10 и классификации Научного центра психического здоровья РАМН. По МКБ-10 диагноз параноидной шизофрении (рубрика F20) был поставлен 52 больным (в соответствии с классификацией НЦПЗ РАМН в эту группу вошли больные с непрерывным и приступообразно-прогредиентным

течением заболевания), диагноз шизоаффективного психоза (F25) — 15, шизотипического расстройства личности (F21), или вялотекущей шизофрении — 8. Все больные на момент обследования принимали различные психотропные препараты.

Группа родственников включала 71 человека — 36 мужчин и 35 женщин, средний возраст 45,58±12,14 года. Из них родителей пробандов было 59, сибсов — 12.

Все обследуемые, в том числе родственники больных, дали информированное согласие на исследование. Родственники прошли психиатрическое обследование и были признаны психически здоровыми.

Нейрофизиологическое обследование предусматривало регистрацию слуховых ВП в стандартной парадигме oddball

ñвероятностью предъявления целевого стимула (тон, частота 2 кГц, интенсивность 60 дБ) — 0,2 и нецелевого (тон, частота 1 кГц, интенсивность 60 дБ) — 0,8. Крутизна переднего и заднего фронтов тоновых посылок составляла 10 мс, длительность сигнала — 50 мс. Общее число целевых стимулов равнялось 30, они подавлялись бинаурально в квазислу- чайном порядке, межстимульный интервал, который составлял в среднем 1,5 с, варьировал в диапазоне 20%. Обследование проводили в первой половине дня не ранее чем спустя час после приема пищи. Испытуемые в положении лежа

ñзакрытыми глазами должны были нажимать большим пальцем ведущей (правой руки) на кнопку в ответ на предъявление целевого стимула и пропускать нецелевые. Перед каждым обследованием проводилась обучающая серия. ЭЭГ регистрировали на электроэнцефалографе Эра-14-21 (Италия) в 16 отведениях с референтными ипсилатеральными ушными электродами. Полоса пропускания была от 0,5 до 35 Гц. ВП усредняли по системе картирования Brain Atlas (“Biologic”, США). Эпоха анализа составляла 512 с, престимульный интервал — 60 мс. Визуализация ВП, коррекция амплитуд относительно престимульного интервала и выделение (вручную) характеристических точек для измерения пиковых амплитуд и латентностей осуществляли с помощью специальной программы. Компонент Р300 выделялся как наибольшая позитивная волна в интервале 280—450 мс. Его пиковые латентности и амплитуды определяли в отве-

дениях F3, F4, F7, F8, Т3, Т4, С3, СZ, Ñ4, Ð3, ÐZ и Р4. Молекулярно-генетическое исследование предусматри-

вало отбор венозной крови больных, выделение ДНК с применением очистки фенолом и хлороформом и генотипирование с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полиморфные варианты 5-HTTLPR выявляли с ис-

пользованием олигонуклеотидных праймеров 5′-GGCGTTGCCGCTCGTAATGC-3′ и 5′-GAGGGACTGAGCT- GGACAACC-3′. Реакционная смесь содержала 100 нг ДНК, 200 мкМ дезоксинуклеотидтрифосфаты, 10 пмоль каждого

праймера, 3% формамид, 0,05 ед. Taq-полимеразы и 10х буфер для Taq-полимеразы. После денатурации ДНК при 94 °С

âтечение 4 мин проводили 30 циклов ПЦР при следующих условиях: 94 °С — 30 с, 60 °С — 30 с, 72 °С — 30 с. Полученные фрагменты ДНК разделяли в 5% полиакриламидном геле.

Для определения аллельного полиморфизма гена 5-HTR2A ПЦР проводили в 30 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl pH 8,8; 16,7 мМ сульфат аммония;

1,5 мМ хлорид магния; 0,2 мМ каждого dNTP, 1/5 ед. полимеразы TaqR, 100 нг геномной ДНК. В реакционную смесь вноси-

ли по 50 нг каждого из олигонуклеотидных праймеров с последовательностью нуклеотидов 5′-TCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3′ и 5′-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3′ соответственно. Проводили 30 циклов ПЦР по следующей программе: 94 °С — 1 мин, 62 °С — 45 с, 72 °С — 1,5 мин, в том числе первая денатурация 3 мин, последний синтез цепи 5 мин. Полученную в результате ПЦР последовательность ДНК длиной 342 пары оснований инкубировали с рестриктазой Мsp с последующим разделением полученных фрагментов в 3% агарозном геле.

Генотипирование по полиморфным маркерам гена DRD4 (-809G/A, -616G/C и -521С/Т) проводили следующим образом. На первом этапе осуществляли ПЦР участка ДНК, содержащего все 3 сайта, при следующих условиях: денатурация в течение 5 мин при 95 °С, 35 циклов амплификации (95 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С — 90 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 °С 10 мин. Реакционная смесь содержала диметилсульфоксид в концентрации 10%.

При генотипировании СОМТ денатурацию проводили

âтечение 5 мин при 95 °С, далее следовали 30 циклов амплификации (95 °С — 30 с, 55 °С — 30 с, 72 °С — 30 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 °С 5 мин. Полиморфные участки генов выявляли на анализаторе ДНК ABI Prism 310 по методике и с реагентами набора “SnaPshot ddNTP Primer Extention Kit”. Праймеры для амплификации и выявления полиморфизма представлены ниже.

Для статистической обработки данных использовали дисперсионный анализ. Сравнения между группами и между генотипами были проведены с применением однофакторного дисперсионного анализа. Влияние генотипа и возраста на показатели Р300 определяли с помощью многофакторного дисперсионного анализа. Средние значения показателей Р300 в группах сравнивали с помощью критерия Стьюдента. Связь между показателями Р300 и клиническими признаками оценивали с использованием корреляций

Пирсона.

Результаты и обсуждение

Средние значения латентности и амплитуды Р300 в группах больных и их здоровых родственников приведены в табл. 1. При статистическом анализе достоверных межгрупповых различий выявлено не было. И

хотя этот факт совпадает с данными некоторых исследований [23], здесь нельзя исключить влияния возраста. Корреляции между возрастом и амплитудой Р300, носящие негативный характер, были выявлены нами в отведении РZ у больных (r= –0,26; р=0,01), между возрастом и латентностью Р300 (прямая зависимость) в отведении РZ (r=0,31; р=0,01) у больных и в отведении Р3 (r=0,28; р=0,02) у их родственников. Тем не менее при дальнейшем анализе связи мо- лекулярно-генетических и нейрофизиологических показателей фактор возраста был исключен, так как группы с разными генотипами не отличались по этой характеристике.

Оценка показателей Р300 с учетом генотипов показала, что полиморфизм генов 5-HTR2A, перенос- чика серотонина и DRD4 (маркер -616G/C) не был значимо связан с величинами латентности и амплитуды ни у больных шизофренией и расстройствами шизофренического спектра, ни у их родственников. Однако маркеры -809G/A и -521С/Т гена DRD4, а также полиморфизм гена СОМТ оказывали значимое влияние на компонент Р300 (табл. 2). В частности, у больных с генотипом GG (маркер -809G/A) по сравнению с носителями генотипа АА обнаружено дос-

товерное снижение амплитуды Р300 во всех лобных отведениях: F7 (t=2,7; df=19; p=0,01); F3 (t=2,5; df=19; p=0,02); F4 (t=2,3; df=19; p=0,03); F8 (t=2,7; df=19; p=0,01). В группе родственников найдены значимые различия в величине латентности в центральном отведении для носителей генотипа СС (маркер -521С/Т), которая была значительно меньше, чем в объединенной группе испытуемых с генотипами ТС и ТТ (t=3,03; df=32; p=0,0047). Незначительные отличия, хотя и достигающие уровня значимости (t=2,18; df=16; p=0,044), были обнаружены между носителями генотипов СС и ТТ в величине амплитуды (височное отведение справа). Полиморфизм гена СОМТ был достоверно связан с амплитудой Р300 в центральном (t=2,9; df=16; p=0,01) и теменном (t=2,26; df=16; p=0,004) отведениях левого полушария, при этом более низкие значения амплитуды отмечены для генотипа Val/Val.

Таким образом, в нашем исследовании полиморфизм генов серотонинергической системы не был связан с компонентом Р300, что не противоречит данным более ранних работ [12, 39], посвященных изучению вклада генов серотонинергической системы в электрическую активность мозга. Что касается

1.Алфимова М.В., Уварова Л.Г., Трубников В.И. Метод вызванных потенциалов в исследовании познавательных процессов при шизофрении. Журн неврол и психиат 1999; 99: 1: 62—68.

2.Лебедева И.С., Каледа В.Г., Цуцульковская М.Я. О сопряженности изменений клинического состояния больных шизофренией с параметрами слуховых вызванных потенциалов и фоновой электроэнцефалограммы. Журн неврол и психиат 2003; 103: 7: 16—20.

3.Лебедева И.С., Орлова В.А., Каледа В.Г. и др. Биоэлектрическая активность головного мозга у родителей больных шизофренией. Журн неврол и психиат 2003; 103: 11: 43—48.

4.Anokhin A.P., Todorov A.A., Madden P.A. et al. Brain event-related potentials, dopamine D2 receptor gene polymorphism, and smoking. Genet Epidemiol 1999; 1: 17: Suppl 1: 37—42.

5.Blackwood D.H., Glabus M.F., Dunan J. et al. Altered cerebral perfusion measured by SPECT in relatives of patients with schizophrenia. Correlations with memory and P300. Br J Psychiat 1999; 175: 357—366.

6.Blum K., Braverman E.R., Dinardo M.J. et al. Prolonged P300 latency in a neuropsychiatric population with the D2 dopamine receptor A1 allele. Pharmacogenetics 1994; 4: 6: 313—322.

7.Bramon E., Rabe-Hesketh S., Sham P. Meta-analysis of the Ð300 and Ð50 waveforms in schizophrenia. Schizophr Res 2004; 70: 2—3: 315—329.

8.Chen T.J., Yu Y.W., Chen J.Y. et al. Association analysis of two dopamine D2 receptor gene polymorphisms and P300 event-relat- ed potential in depressive patients. Neuropsychobiology 2002; 46: 3: 141—144.

9.d’Ardhuy X.L., Boeijinga P.H., Renault B. et al. Effects of serotoninselective and classical antidepressants on the auditory P300 cognitive potential. Neuropsychobiology 1999; 40: 4: 207—213.

10.Egan M.F., Duncan C.C., Suddath R.L. Event-related potential abnormalities correlate with structural brain alterations and clinical features in patients with chronic schizophrenia. Schizophr Res 1994;

11:3: 259—271.

11.Egan M.F., Goldberg T.E., Gscheidle T. Relative risk for cognitive impairments in siblings of patients with schizophrenia. Biol Psychiat 2001; 50: 2: 98—107.

14.Frangou S., Sharma T., Alarcon G. et al. The Maudsley Family Study,

II:Endogenous event-related potentials in familial schizophrenia. Schizophr Res 1997; 23: 1: 45—53.

15.Gallinat J., Bajbouj M., Sander T. et al. Association of the Gl947A COMT (Val(108/158)Met) gene polymorphism with prefrontal P300 during information processing. Biol Psychiat 2003; 54: 1: 40—48.

16.Glatt S.J., Faraone S.V., Tsuang M.T. Association between a functional catechol-O-methyltransferase gene polymorphism and schizophrenia: meta-analysis of case-control and family-based studies. Am J Psychiat 2003; 160: 3: 469—476.

17.Goldberg T.E., Egan M.F., Gscheidle T. et al. Executive subprocesses in working memory: relationship to catechol-O-methyltransferase Val158Met genotype and schizophrenia. Arch Gen Psychiat 2003;

60:9: 889—896.

18.Gritsenko I.K., Golimbet V.E., Abramova L.I. et al. An associative study of DRD4 gene polymorphisms in promoter region and clinical features of schizophrenic patients. Am J Med Genet 2004; 130B:

1:86.

19.Halgren E., Marinkovic K., Chauvel P. Generators of the late cognitive potentials in auditory and visual oddball tasks. Electroencephalogr Clin Neurophysiol 1998; 106: 2: 156—164.

20.Hansenne M., Ansseau M. P300 event-related potential and seroton- in-1A activity in depression. Eur Psychiat 1999; 14: 3: 143—147.

21.Higashima M., Nagasawa T., Kawasaki Y. et al. Auditory P300 amplitude as a state marker for positive symptoms in schizophrenia: crosssectional and retrospective longitudinal studies. Schizophr Res 2003;

59:2—3: 147—157.

22.Jeon Y.W., Polich J. Meta-analysis of P300 and schizophrenia: patients, paradigms, and practical implications. Psychophysiology 2003;

40:5: 684—701.

23.Kidogami Y., Yoneda H., Asaba H. et al. P300 in first degree relatives of schizophrenics. Schizophr Res 1991; 6: 1: 9—13.

24.Malhotra A.K., Kestler L.J., Mazzanti C. et al. 2A functional polymorphism in the COMT gene and performance on a test of prefrontal cognition. Am J Psychiat 2000; 159: 4: 652—654.

25.Muller T.J., Kalus P., Strik W.K. The neuropsychological meaning of auditory P300 in subtypes of schizophrenia. Wld J Biol Psychiat 2001; 2: 9—17.

tonin transporter function modulates the brain electrical response for error processing. Neuropsychopharmacology 2004; 29: 8: 1506— 1511.

13.Fossella J., Sommer T., Fan J. et al. Assessing the molecular genetics of attention networks. BMC Neuroscience 2002; 3: 14—21.

ropsychological correlates of the P300 in schizophrenia. Schizophr Res 2002; 55: 1—2: 105—113.

27.Noble E.P., Berman S.M., Ozkaragoz T.Z. et al. Prolonged P300 latency in children with the D2 dopamine receptor A1 allele. Am J Hum Genet 1994; 54: 4: 658—668.

morphism un the promoter region of DRD4 associated with the human novelty seeking personality trait. Mol Psychiat 2000; 5: 64— 69.

29.Polich J. P300 in clinical application. In: E. Niedermeyer, F. Lopes da Silva. Electroencephalography. Basic principles, clinical applications, and related fields. 4th edition, Williams&Wilkins, A Waverly Company 1999; 1073—1085.

30.Pritchard W.S. Cognitive event-related potentials correlates of schizophrenia. Psychol Bull 1986; 100: 43—66.

31.Rosa A., Peralta V., Cuesta M.J. et al. New evidence of association between COMT gene and prefrontal neurocognitive function in healthy individuals from sibling pairs discordant for psychosis. Am J Psychiat 2004; 161: 6: 1110—1112.

32.Seeman P., Guan H.C., Van Tol H.H. Dopamine D4 receptors elevated in schizophrenia. Nature 1993; 365: 6445: 441—445.

33.Shifman S., Bronstein M., Sternfeld M. et al. A highly significant association between a COMT haplotype and schizophrenia. Am J Hum Genet 2002; 71: 6: 1296—1302.

dopamine receptor mRNA in postmortem schizophrenic brain. Brain Res Mol Brain Res 1998; 53: 1—2: 112—119.

35.Stefansson S.B., Jonsdottir T.J. Auditory event-related potentials, auditory digit span, and clinical symptoms in chronic schizophrenic men on neuroleptic medication. Biol Psychiat 1996; 40: 1: 19—27.

36.Tsai S.J., Yu Y.W., Chen T.J. et al. Association study of a functional catechol-O-methyltransferase-gene polymorphism and cognitive function in healthy females. Neurosci Lett 2003; 338: 2: 123—126.

37.Turetsky B., Colbath E.A., Gur R.E. P300 subcomponent abnormali-

ties in schizophrenia: II. Longitudinal stability and relationship to symptom change. Biol Psychiat 1998; 43: 1: 31—39.

38.Weinberger D.R., Egan M.F., Bertolino A. et al. Prefrontal neurons and the genetics of schizophrenia. Biol Psychiat 2001; 50: 11: 825— 844.

39.Yu Y.W., Tsai S.J., Yang K.H. et al. Evidence for an association between polymorphism in the serotonin-2A receptor variant (102T/

C)and increment of N100 amplitude in schizophrenics treated with clozapine. Neuropsychobiology 2001; 43: 2: 79—82.