Журнал неврологии и психиатрии / 2007 / NEV_2007_01_06

Развитие оксидантного стресса возможно в условиях как недостаточности, так и избыточности кислорода [1, 9]. Он играет одну из ведущих ролей в патогенезе ишемического инсульта и развивается уже в первые часы ишемии [3]. Спонтанная или индуцированная реканализация сосуда, а также наличие коллатералей способны приводить к реоксигенации ишемизированной зоны мозга, что может вызывать новую волну оксидантного стресса. Хорошо известно, что важнейшее значение в резистентности нервной ткани к подобного рода воздействиям играет состояние биоэнергетики митохондрий [15]. Ранее была по-

© Коллектив авторов, 2007

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2007;107:1:30—36

казана эффективность применения цитохимических методов для сравнительного анализа изменений митохондриальных процессов при различных патологи- ческих состояниях [5]. Поэтому использование методик определения активности ферментов in situ наряду с количественным описанием состояния антиоксидантной системы и динамическим мониторингом физиологических показателей крови пациентов позволяет выявить новые патогенетические особенности процесса формирования ишемического очага на молекулярном уровне.

Целью данного исследования явилась оценка изменений газового состава артериальной крови, состояния антиоксидантной системы и уровня митохондриальных ферментов в остром периоде ишеми- ческого инсульта.

Материал и методы

В основу работы положены результаты обследования 37 больных с ишемическим инсультом в каротидной системе в возрасте 45—85 лет (средний 71,4±9,2 года) — 13 мужчин и 24 женщины.

Критериями включения в исследование являлись клиническая картина первого в жизни ишемического инсульта в каротидной системе атеротромботического или кардиоэмболического генеза по критериям TOAST (Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment), поступление в клинику в первые 24 ч развития заболевания. Критериями исключения были полный регресс неврологической симптоматики в течение 24 ч от начала заболевания, наличие лакунарного инсульта (по ТOAST), а также острого инфаркта миокарда, выраженной сердечной, печеночной или почечной недостаточности и других состояний, сопровождающихся грубыми нарушениями системной гемодинамики и метаболизма.

На основании анализа неврологического статуса больных разделили на две группы (табл. 1): с инсультом средней тяжести (балл по шкале NIH на момент госпитализации от 3 до 13 и с тяжелым (NIH≥14).

Всем пациентам проводили максимально унифицированную базисную терапию в соответствии с рекомендациями Европейской инициативной группы по проблеме инсульта (EUSI, 2003) [7]. Учитывая эффективность глицина, доказанную в ходе рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируе- мого исследования [11], во всех случаях в остром периоде заболевания этот нейропротектор назначали в дозе 1 г раз в сутки сублингвально.

Группа контроля включала 27 практически здоровых добровольцев, у которых в анамнезе не было инсульта или транзиторных ишемических атак.

Проводили исследование соматического и неврологического статуса больных по общепринятым методикам при поступлении и затем на 3, 7, 14 и 21-е сутки инсульта. Для объективизации тяжести состояния, выраженности очагового неврологического дефицита и оценки динамики клинических показателей использовали балльную шкалу NIH (H. Adams и J. Biller, 1989). Степень функционального восстановления определяли на 21-е сутки инсульта с помощью индекса Бартел.

Ишемический характер инсульта был установлен по данным анамнеза, клинической картине заболевания и подтвержден результатами МРТ головного мозга. Патогенетический вариант развития заболевания определяли в соответствии с критериями TOAST, на основании анамнеза и особенностей клинической картины, данных ультразвуковой допплерографии

ИШЕМИЧЕСКИЙ ИНСУЛЬТ

магистральных артерий головы, электро-, эхокардиографии, МРТ, лабораторных показателей.

Для анализа газового состава крови использовали газоанализатор ABL 500 («Radiometer», Дания). Кровь брали из бедренной артерии по общепринятой методике в гепаринизированные шприцы при поступлении, на 3-и и 7-е сутки от начала инсульта.

Для определения активности ферментов антиоксидантной системы — супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы, концентрации восстановленного глутатиона (глутатион SH) и вторичных продуктов перекисного окисления липидов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБКРП), в 1-е сутки заболевания (при поступлении, до начала терапии), на 3, 7 и 14-е сутки брали кровь из локтевой вены (10,0 мл) с использованием вакуумных пробирок, содержавших гепарин, немедленно разделяли ее на клеточный компонент и плазму (центрифугированием в течение 15 мин при 2000 об/мин на центрифуге ОС-6М) с помощью стандартных пипеток, помещали в эпиндорфы (1,0 мл) и замораживали при —20°С. Активность ферментов определяли спектрофотометрически на спектрофотометре SPECORD W-VIS в кювете с перемешиванием при толщине слоя 1 см. Расчет активности ферментов проводили на 1 мг гемоглобина. Концентрацию гемоглобина в гемолизате определяли гемоглобинцианидным методом.

Для исследования цитохимических показателей крови в те же сроки — при поступлении, на 3, 7 и 14-е сутки от начала инсульта брали капиллярную кровь, готовили мазки, высушивали и фиксировали в течение 30 с 10% раствором спирт-формалина (для определения активности щелочной фосфатазы — ЩФ) или раствором ацетона, насыщенным трилоном Б (для определения активности сукцинатдегидрогеназы — СДГ и α-глицерофосфатдегидрогеназы — α-ГФДГ). Затем предметные стекла с мазками промывали дистиллированной водой и высушивали. Окраску мазков проводили методом азосочетания (для определения активности ЩФ) и методом Р.П. Нарциссова (с помощью солей тетразолия) для определения активности СДГ и α-ГФДГ. После этого осуществляли микрокопирование мазков под масляной или водной иммерсией, подсчитывали прокрашенные гранулы и определяли активность ферментов.

ЭЭГ регистрировали по стандартной методике на приборе EEG-24 (фирма МБН, Москва) в течение 15 мин до начала терапии, а также на 3, 7 и 14-е сутки заболевания. Использовали монополярный монтаж, 19 активных электродов, располагавшихся на коже головы по международной системе 10—20 относительно раздельных референтных ушных электродов.

но при этом активность α-ГФДГ оставалась в 2,7 раза выше контроля (см. табл. 3).

Таким образом, в первые часы ишемического инсульта имеет место преобладание первой (компенсаторной) стадии биоэнергетической гипоксии, о чем свидетельствует тенденция к повышению активности СДГ [6]. Отсутствие достоверного ее повышения, по всей видимости, связано с большей выраженностью этого процесса в более ранние сроки инсульта. Можно предположить, что повышение активности α-ГФДГ

â1-å сутки инсульта является следствием активации гликолиза, наиболее выраженной в первые 12 ч от начала заболевания, о чем свидетельствует и резкое повышение активности ЩФ в те же сроки.

Ó16 больных с инсультом разной тяжести, не получавших препаратов с антиоксидантными и ан-

тигипоксантными свойствами, было проведено исследование активности СДГ, α-ГФДГ и ЩФ в динамике.

Óбольных обеих групп наблюдалось снижение активности СДГ лимфоцитов по сравнению с контрольными значениями, особенно выраженное к 7-ì

и 14-м суткам инсульта (рис. 1).

Активность α-ГФДГ по сравнению с СДГ претерпевала обратные изменения — отмечалась общая тенденция к ее повышению. Обращает на себя внимание достоверное повышение активности этого фермента у больных с инсультом средней тяжести на 3-и сутки заболевания по сравнению как с контролем,

так и с группой больных с тяжелым инсультом. При этом активность α-ГФДГ у больных с тяжелым инсультом на 3-и сутки заболевания достоверно не отличалась от таковой в группе контроля (рис. 2).

Активность ЩФ нарастала к 3-м суткам инсульта

âобеих группах, однако достоверные отличия от контроля установлены только у больных с тяжелым инсультом, что свидетельствует о выраженности у них процессов деструкции [4, 12]. После 3-х суток активность фермента между группами была разной: у пациентов с инсультом средней тяжести она не отлича- лась от контроля, а при тяжелом инсульте сохранялась высокой, причем на 14-е сутки различия между группами достигли уровня достоверности (рис. 3).

Кроме того, выявлено достоверное повышение активности ЩФ на 7-е сутки инсульта у больных с тяжелой инвалидизацией по сравнению с контролем и группой больных с хорошим восстановлением неврологических функций (рис. 4).

При анализе активности ферментов антиоксидантной системы, концентрации глутатиона SH и ТБКРП

âпериферической крови уже в первые часы заболевания определялось снижение активности глутатионпероксидазы, концентрации глутатиона SH и повышение концентрации ТБКРП по сравнению с контрольными значениями. Позднее (у больных, госпитализированных в первые 12—24 ч) наблюдалось снижение активности супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионредуктазы, глутатионпероксидазы по сравнению как с контрольными значениями, так и с больными, госпитализированными в более ранние сроки (3—12 ч от дебюта заболевания). При динамическом наблюдении выявлено снижение при сравнении с контролем активности супероксиддисмутазы, катала-

Рис. 2. Активность α-ГФДГ у больных с инсультом разной тяжести.

* — р<0,05, ** — р<0,01 по сравнению с контролем; ^ — р<0,01 по сравнению с группой тяжелых больных.

Рис. 4. Активность ЩФ у больных с разной степенью функционального восстановления на 21-е сутки инсульта.

Здесь и на рис. 6 и 7 в парах столбцов: темные — тяжелая инвалидизация, светлые — хорошее восстановление. * — р<0,01 по сравнению с контролем; ** — р<0,01 по сравнению с группой больных c тяжелой инвалидизацией.

зы, глутатионпероксидазы, концентрации глутатиона SH (табл. 4).

Среднее содержание ТБКРП по группе в целом не отличалось от контроля, однако у больных с тяжелым инсультом выявлено его достоверное повышение во все моменты исследования, по сравнению с контролем, и на 7-е сутки, по сравнению с больными инсультом средней тяжести (рис. 5). Кроме того, у больных с плохим восстановлением неврологических функций отмечалось повышение концентрации ТБКРП на 14-е сутки инсульта, по сравнению как с контролем, так и с группой хорошего восстановления (рис. 6).

Активность супероксиддисмутазы также влияла на исход инсульта: у больных с плохим восстановлением она была ниже контрольного значения на всех этапах исследования, а также ниже, чем у больных с хорошим восстановлением на 7-е и 14-е сутки (рис. 7).

При анализе зависимостей между баллом по NIHSS и интегральным показателем ЭЭГ (Int=βα/θ∆) были установлены тесные отрицательные связи во все моменты исследования как для интактного, так и для пораженного полушария головного мозга (r=–0,6; p<0,01). Таким образом, было подтверждено, что чем тяжелее инсульт (выше балл по NIH), тем ниже интегральный показатель ЭЭГ, отражающий соотношение основных ритмов ЭЭГ и патологических медленных ритмов.

При анализе зависимостей показателей кислородного статуса и клинико-электроэнцефалографических характеристик больных были выявлены прямые корреляции между SaO2 в 1-е сутки инсульта и баллом по NIHSS на 7-е (r=0,8; р<0,01) и обратные (r=–0,8; р<0,01) между SaO2 в 1-е сутки и Int (для обоих полушарий) на 7-е (рис. 8). Кроме того, установлены корреляции между SaO2 в 1-е сутки и баллом по NIHSS на 14-е (r=0,7; р<0,05); SaO2 в 1-е сутки и Int для пораженного полушария мозга на 3-и (r=–0,8; р<0,05) и 7-е сутки (r=–0,9; р<0,01).

Рис. 7. Активность супероксиддисмутазы у пациентов с разной степенью восстановления на 21-е сутки инсульта.

* — р<0,05; ** — р<0,01 по сравнению с группой контроля; ^ — р<0,05; ^^ — р<0,01 по сравнению с группой больных с тяжелой инвалидизацией.

Рис. 8. Корреляции между насыщением гемоглобина артериальной крови кислородом (SaO2), баллом по NIHSS и интегральным показателем ЭЭГ (Int).

Установлены связи между активностью супероксиддисмутазы на 3-и сутки инсульта и баллом по NIHSS в 1-е сутки (r=–0,4; р<0,05), активностью супероксиддисмутазы на 14-е сутки и баллом по NIHSS на 3, 7 и 14-е сутки (r=–0,4; р<0,05); между активностью супероксиддисмутазы на 14-е сутки и Int как для пораженного, так и для интактного полушария мозга на 3-и (r=0,6; р<0,01), активностью супероксиддисмутазы на 3-и сутки и Int (для обоих полушарий) на 14-е (r=0,6; р<0,01) (рис. 10).

Более тесные связи определены между концентрацией ТБКРП и Int: концентрацией ТБКРП в 1-е, на 3, 7 и 14-е сутки инсульта и Int как для пораженного, так и для здорового полушария на 3-и сутки (r=–0,5; р<0,01); концентрацией ТБКРП в 1-е сутки и Int для пораженного полушария на 7-е (r=–0,4; р<0,01); концентрацией ТБКРП на 7-е сутки и баллом по NIHSS в 1-е, на 3-и и 7-е сутки (r=0,5; р<0,01) (рис. 11).

Кроме того, установлены зависимости между % PaO2 на 3-и сутки и активностью супероксиддисмутазы на 7-е сутки (r=–0,8; р<0,05); PaO2 è SaO2 на 3-и сутки и активностью супероксиддисмутазы на 14-е (r=–0,9; р<0,05); PaO2 è SaO2 на 3-и сутки и концентрацией ТБКРП на 14-е (r=0,9; р<0,05).

Полученные корреляции свидетельствуют о том, что повышение SaO2 и процента от расчетного PaO2 в 1-е сутки инсульта соотносится с преобладанием патологических медленных ритмов ЭЭГ над основными и с более тяжелым течением инсульта (выше балл по шкале NIH). Кроме того, сохранение высоких значений PaO2, SaO2 è %PaO2 на 3-и сутки инсульта связано со снижением активности супероксиддисмутазы и повышением концентрации ТБКРП. Последние в свою очередь тесно коррелируют как с тяжестью инсульта, так и с интегральным показателем ЭЭГ.

Таким образом, относительная гипероксия отрицательно влияет на биоэлектрическую активность мозга и течение инсульта по причине активации процессов оксидантного стресса.

3.Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М: Медицина 2001.

4.Загурский А.А. Щелочная фосфатаза клеток человека, культивируемых in vitro: активность, свойства и их роль в клеточной регуляции: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М 1986.

5.Комисарова И.А. Применение цитохимических методов исследования лейкоцитов крови для оценки состояния больных в острый период ишемического инсульта. Клинико-лабораторный консилиум. М 2004; 2: 9—13.

6.Лукьянова Л.Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. Бюл экспер биол 1997; 124: 9.

7.Методические рекомендации по профилактике и лечению инсульта. Европейская инициативная группа по проблеме инсульта. М 2003.

1991.

10.Рябов Г.А. Гипоксия критических состояний. М: Медицина 1988.

11.Скворцова В.И., Раевский К.С., Коваленко А.В. и др. Журн неврол и психиат 1999; 99: 2.

12.Соколов В.В., Нарциссов Р.П., Иванова Л.А. Цитохимия ферментов в профпатологии. М: Медицина 1975.

13.Царенко С.В. Нейрореаниматология. Интенсивная терапия че- репно-мозговой травмы. М: Медицина 2005.

14.Nelson D.L., Cox M.M. Leninger principles of biochemistry 4-th ed.W.H. Freeman & Company N.Y. 1119.

15.Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival. Physiological Rev 2000; 80, 315—360.