Тема 4. Дослідження бактерій у непофарбованому вигляді

Лабораторне заняття 1. Дослідження бактерій на рухливість. Визначення величини мікроорганізмів.

Мета. Оволодіти методикою мікроскопічного дослідження бак­терій у нативному (непофарбованому) вигляді, визначення рухливості у бактерій.

Матеріальне забезпечення. Мікроскопи світлові, спиртівки чи га­зові горілки, знежирені предметні та покривні скельця, бактеріологічні петлі, (приможливості—мікроскоп, обладнаний конденсором темного поля, фазово-контрастний мікроскоп).

Мікроскопічне дослідження нативних (нефіксованих, непофарбова-них) бактерій дозволяє охарактеризувати їх морфологічні особливості, не модифіковані під час фіксації (що інколи трапляється), та визначити їх здатність рухатися.

Значна кількість бактерій здатна активно рухатись завдяки наявності у них джгутиків - особливих циліндричних ниткоподібних структур, що відходять від базальних тілець цитоплазматичної мембрани. Довжина джгутиків значно перевищує величину мікробної клітини. Джгутики досить тонкі (0,03-0,06 мкм), і їх не видно у звичайному світловому мікроскопі, роздільна здатність якого становить 0,2 мкм. До складу джгутиків входить особливий білок флагелін, який є повноцінним антигеном і відрізняється від соматичних антигенів клітини.

Залежно від кількості джгутиків бактерії поділяють на: монотрихи - ма­ють один джгутик на полюсі клітини; лофотрихи - мають пучок джгутиків на одному з кінців клітини; амфітрихи - яв­ляють собою перехідну форму і містять по одному джгутику або їх пучку на кожному полюсі; перитрихи - джгутики розміщено по всій поверхні мікробної клітини (рис. 14).

Джгутики погано сприймають барвники, тому в лабораторних умовах використовують спеціальні методи пофарбування (сріблення за Морозовим чи ін). Проте з метою визначення рухливості частіше мікроскопують нативні непофарбовані препарати. Для цього готують препарат "роздавлена крапля" або ж препарат "висяча крапля".

Для дослідження на рухливість придатні молоді (18-20 годин) бульйонні культури або конденсат агарових культур. Як виняток, можна обережно суспендувати у фізіологічному розчині бактеріальну масу, вирощену на щільному середовищі, а одержану суспензію використати для дослідження бактерій на рухливість. Слід мати на увазі те, що ви­рощені на щільному середовищі деякі здатні до руху бактерії можуть її тимчасово втрачати та поновлювати при культивуванні на рідкому середовищі. На інтенсивність руху бактерій може впливати температу­ра. Тому бажано предметне скло перед отриманням препарату злегка підігріти.

Методика "роздавлена крапля". Для приготування препарату "роз­давлена крапля" краплю культури наносять на предметне скло, накрива­ють покривним скельцем так, щоб рідина не вийшла за його межі.

Методика приготування препарату "висяча крапля". Краплю досліджуваної культури наносять на покривне скельце. Беруть спеціаль­не предметне скло з лункою. Краї лунки змащують вазеліном, а скло спрямовують лункою донизу, в на­прямку краплі, (орієнтуючись таким чином, щоб крапля розмістилась у центрі лунки, злегка притискують і зразу ж перевертають (рис. 15).

Порядок дослідження пре­паратів обох типів у світловому мікроскопі.

Установлюють об'єктив малого збільшення і рівномірно освітлюють поле зору.

Опускають наполовину конденсор і злегка прикривають діафрагму.

3. Знаходять край краплі (має вигляд ламаної лінії,) и зміщують її до центру поля зору.

4. Встановлюють об'єктив середнього збільшення (40 х), знаходять бактерії, які розміщуються на світлішій половині, і переконуються в їх активній рухливості. При цьому видно, що бактерії рухаються в різних напрямках з різною швидкістю.

Справжній рух слід відрізняти від броунівського, зумовленого переміщеннями молекул рідини. У цьому випадку бактерії немовби "товчуться" на місці. Якщо столик мікроскопа стоїть нерівно, то всі бактерії рухаються в одному напрямку з однаковою швидкістю.

Рухливість бактерій краще спостерігається при використанні тем-нопольної та фазово-контрастної мікроскопії.

З допоміжних методів при дослідженні бактерій на рухливість застосовують посів культур уколом у напіврідкий агар. У позитивних випадках спостерігають дифузний ріст культури від лінії уколу. Один з методів передбачає посів культури в конденсатну рідину щільного середовища. Нерухливі бактерії розмножуються тільки в рідині, тоді як рухливі види заселяють всю поверхню середовища. Якісні результати при дослідженні бактерій на рухливість одержують при використанні методу "темного поля".

Визначення величини мікроорга­нізмів. З цією метою використовують мікрометр окулярний гвинтовий (МОГ), який встановлюють на тубус мікроско­па. У складі мікрометра є компенсацій­ний окуляр з діоптрійною установкою, стаціонарна й рухома сітки, барабан із шкалою, кожна поділка якого дорівнює 10 мкм (рис. 16).

Стаціонарна сітка поля зору мікро­метра має вісім поділок (від 0 до 8), відстань між якими становить 1 мм. На рухомій сітці нанесено перехрестя і дві риски (біштрих), які при обер­танні барабана переміщуються вздовж стаціонарної шкали (рис. 17). Повний оберт барабана (від 0 до 100) переміщує біштрих на одну поділку стаціонарної шкали, яка призначена для відрахунку кількості повних обертів барабана.

Перш ніж приступити до виміру ве­личини мікроскопічних об'єктів, необхід­но визначити коефіцієнт збільшення кон­кретного об'єктива. Для цього на столик мікроскопа встановлюють об'єкт-мікро-метр - спеціальне предметне скло, у цен­трі якого є особлива шкала з величиною поділок 10 мкм (рис. 18). Чітке зображення цієї шкали суміщують в одній площині з рухомою шкалою окулярного мікрометра й підраховують, скільки поділок шкали окуляра і його барабана вміщується в одну або декілька поділок об'єкт-мікрометра. Наприклад, шість поділок об'єкт-мікрометра вмістилось у чотири поділки стаціонарної шкали оку­ляра. В такому випадку коефіцієнт збільшення (К) становитиме:

4мм

К = = 66 х

0,06мм

Одержавши цю величину, об'єкт-мікрометр знімають і на його місце кладуть досліджуваний препарат. При визначенні розміру пев­ного об'єкта на одному з його кінців встановлюють біштрих рухомої шкали окулярного мікрометра, обертаючи барабан, підраховують, через скільки повних поділок стаціонарної шкали пройде біштрих до кінця об'єкта та, додаючи при цьому певну кількість поділок шкали барабана. Наприклад, біштрих "пройшов" через одну поділку (1 мм) стаціонарної шкали і "перейшов" на певну величину другої поділки. На це переміщення в межах наступної поділки пішло 35 поділок шкали барабана (кожна з них має 10 мкм). Склавши ці величини, одержимо 1 350 мкм. З урахуванням коефіцієнта збільшення довжина об'єкта в даному прикладі становитиме 1 350 мкм : 60 = 20,46 мкм