1. Нанесення досліджуваного матеріалу на предметне скло.

Краплю культури, вирощеної на рідкому живильному середовищі, за допомогою стерильної бактеріологічної петлі або пастерівської піпетки наносять на середину предметного скла та розміщають (розмазують) тонким шаром площею близько 2 см², таким чином, щоб не виходити до країв скла. Якщо культуру вирощено на щільному живильному середовищі, то на предметне скло спочатку наносять краплю стериль­ного фізіологічного розчину або стерильної води, в якій розтирають частину бактеріальної маси, решту якої спалюють. Після остигання петлі мікробну суспензію рівномірно розміщують на склі, як сказано було вище, та стерилізують петлю фламбуванням.

При виготовленні мазків із паренхіматозних органів, лімфатичних вузлів та уражених тканин невеличкий шматок матеріалу відрізають стерильними ножицями й поверхнею зрізу обережно проводять по предметному склу. Поширеними є так звані мазки-відбитки ("кляч-пре-парати"). При цьому поверхнею зрізу матеріалу доторкаються до пред­метного скла і злегка притискують.

Рідкий матеріал (гній, ексудат, мокрота) наносять на середину предметного скла, щіль­но накривають другим предметним склом так, щоб вільною залишилась половина кожного з них. При розтягуванні стекол у протилежні боки одер­жують два мазки.

Краплю досліджува­ної крові наносять біля правого краю предмет­ного скла. Спеціальним шліфованим склом, яке тримають під кутом 45°, доторкуються до краплі й рівномірним рухом розподіляють її по пред­метному склу у вигляді тонкого мазка.

2. Висушування мазків. Це краще робити на повітрі, під скляним ковпаком. Якщо виникає необхідність виготовити препарат швидше, його можна висушити над полум'ям спиртівки (в теплому потоці пові­тря). Слід зауважити, що мазок повинен бути висушений повністю, бо залишки вологи негативно впливають на його якість.

3. Фіксація мазків фізичними та хімічними методами. Суть фізичного методу полягає в тому, що предметне скло мазком догори проводять над полум'ям спиртівки двічі-тричі, утримуючи препарат над полум'ям 2-3 с. Цей метод досить простий, дешевий, доступний, але порівняно "грубий". У зв'язку з цим мазки з деяких матеріалів (напри­клад, крові) фіксують хімічним методом. При цьому на них наносять одну з фіксуючих рідин: метиловий спирт (до 3 хв.), суміш Никифорова (етиловий спирт і етиловий ефір порівну; на 10-15 хв.), етиловий спирт (на 10-15 хв.), ацетон (на 5-10 хв.). Якісні результати одержують піс­ля фіксації мазків парою формальдегіду в бактеріологічних чашках. Використовують і інші фіксатори.

Основна мета фіксації - прикріплення шару досліджуваного мате­ріалу до скла. Разом з тим, мікроорганізми більшості видів при фікса­ції гинуть, що сприяє безпеці роботи у випадку наявності в матеріалі патогенних, а також зумовлює рівномірніше проникнення фарби в елементи мазка.

4. Фарбування мазків здійснюють барвниками анілінового ряду, які промисловість випускає у вигляді порошків або кристалів. За здат- ністю зв'язуватись зі складовими частинами мікробної клітини барв- ники поділяють на основні, або ядерні, які найчастіше застосовують у мікробіології, та кислі (цитоплазматичні). Останні недостатньо чітко забарвлюють нуклеоїд і в цілому мембрану, клітину, тому їх викорис- товують рідко.

Широко застосовують фіолетові (генціановий, метиловий і крис­талічний фіолетовий), червоні (сафранін, фуксин основний), зелені (малахітовий зелений), сині (метиленовий синій) та інші барвники. Готують водні, спиртові й спиртово-водні розчини барвників, робоча концентрація яких, як правило, становить 1-2, інколи - 3-5 %. Рецепти найчастіше вживаних барвників наведено в додатку.

Мазки фарбують простими і складними методами. Суть простого методу зводиться до того, що фіксовані мазки кладуть на спеціальний місток і наносять робочий розчин одного з барвників (фуксин осно­вний, сафранін, метиловий фіолетовий) на 1-2 хв., а метиленовий си­ній - на 3-5 хвилин. Після цього залишки барвника змивають водою й обережно просушують препарати двома смужками фільтрувального паперу. Просушування повинно бути повним, бо навіть сліди вологи з імерсійною рідиною утворюють непрозору емульсію, яка погіршує зображення.

Простим методом бактерії фарбуються в один колір рівномірно, де­які види - зернисто. Інколи спостерігається розщеплення тону кольору. Це явище одержало назву метахромазії.

Лабораторне заняття 2. Складні методи фарбування пре­паратів.

Мета та ж, що і в занятті 1.

Матеріальне забезпечення: крім аналогічного — набір фарб для пофарбування за методом Грама.

На відміну від простого, складні методи фарбування включають не менше двох барвників та інших реактивів. Застосування не менше двох контрастних за кольором барвників дає можливість детально вивчити тинк-торіальні особливості конкретного виду мікроорганізмів, сприяє диферен­ціації видів, дозволяє виявити окремі структури бактеріальної клітини.

Найбільш поширеним універсальним методом фарбування мазків у бактеріологічній практиці є метод Грама.

Методика фарбування мазків за Грамом.

1. На фіксований на полум'ї мазок кладуть смужку фільтрувально­го паперу (розміром меншу від предметного скла), попередньо оброблену розчином основного карболового фіолетового або генціанового фіолетового, і наносять дистильовану воду до повного розчинення барвника. Готовий розчин барвника можна наносити на звичайну смужку фільтрувального паперу.

2. Через 2-3 хв. папір знімають, залишки барвника зливають і на 1-2 хв. наносять розчин Люголя (водний розчин йоду).

3. Розчин Люголя зливають і відразу на 30—60 с наносять 96-градусний етиловий спирт. Препарат рекомендують легенько струшувати, додаючи 2-3 порції спирту до закінчення відділення фіолетових фракцій розчину.

1. Препарат ретельно промивають водою.

2. На 1-2 хв. наносять робочий розчин основного фуксину.

4. Препарат промивають водою, висушують фільтрувальним па­пером і досліджують під імерсійною системою мікроскопа.

Бактерії можуть фарбуватись за Грамом у синій або червоний ко­льори з різними відтінками, що залежить від їх виду (інколи і від віку). Представники першої групи міцно утримують комплексну сполуку, що утворюється між барвниками трифенілметанової групи й йодом із роз­чину Люголя, зберігають темно-фіолетовий колір і називаються грампо-зитивними. Інші бактерії легко знебарвлюються спиртом, на заключному етапі фарбуються в червоний колір і називаються грамнегативними.

Здатність фарбуватись позитивно за Грамом залежить насамперед від структури клітинної стінки, яка у грампозитивних бактерій на 90 % складається з пептидоглікану. Мікрофібрили останнього формують густу сітку, яка сприяє фіксації названої вище сполуки темно-фіоле­тового кольору. У клітинній стінці грамнегативних бактерій товщина шару пептидоглікану у 10-20-разів тонша, ніж у грампозитивних. Його шкрофібрили мають слабкіший зв'язок і утворюють значно більші пори. Тому грамнегативні мікроорганізми легко знебарвлюються спиртом.

Грампозитивність пояснюється також нижчою ізоелектричною точкою, яка у грампозитивних бактерій становить 2,0-3,0 (у грамнега­тивних - відповідно 5,0). Споріднені зв'язки основних барвників з мікро­бною клітиною знаходяться в прямій залежності від цього показника: чим він нижчий, тим сильніші зв'язки.

Фарбування кислотостійких бактерій. У природі як серед пато­генних, так і серед сапрофітів існують види бактерій, які після фарбу­вання карболовим фуксином проявляють стійкість до дії мінеральних кислот, лугів, спиртів, антиформіну тощо: їх називають кислотостійкими. Звичайними розчинами барвників вони фарбуються погано, тому що ма­ють гідрофобні властивості за рахунок наявності у клітинах підвищеного вмісту жирових і жировоскових речовин. Серед патогенних кислотостій­кими є збудники туберкульозу, паратуберкульозу, прокази людини.

При фарбуванні кислотостійких бактерій користуються спеці­альними методами, серед яких найбільшого поширення набув метод Ціля-Нільсена.

1. Мазок фіксують на полум'ї і через смужку фільтрувального па­перу на його поверхню наносять карболовий фуксин Ціля (див. додаток). Розчин барвника підігрівають на полум'ї спиртівки, не допускаючи закипання, й витримують на препараті до 5 хв. у гарячому стані.

2. Після остигання фільтрувальний папір знімають, залишок барв­ника зливають, препарат промивають водою.

3. Мазок знебарвлюють 5 % сірчаною кислотою протягом 3-5 с (до появи жовтого відтінку) й ретельно промивають водою.

4. Додатково препарат фарбують метиленовим синім Леффлера (див. додаток) протягом 3-5 хвилин.

5. Препарат промивають водою, висушують і досліджують з ви­користанням імерсійної системи мікроскопа.

Мікроскопічна картина: кислотостійкі бактерії рубіново-червоно­го кольору. Інші види бактерій, клітини патологічного матеріалу, фон мазка - сині.

Лабораторне заняття 3. Фарбування препаратів з метою ви­явлення спор бацил.

Мета. Оволодіти методикою виявлення спор бацил (клостридій).

Матеріальне забезпечення. Мікроскопи світлові, бактеріологічні петлі, спиртівка, газова горілка), бульйонна культура бацил (сапро­фіт), предметні скельця, набір фарб для пофарбування за методом Мюзареллі.

За певних умов, найчастіше при нестачі поживних речовин і на­громадженні продуктів обміну, бацили утворюють спори - сферичні або овальні структури, розміщені в центрі клітини, ближче до одного з країв або на самому її кінці (центральне, субтермінальне й термінальне розміщення).

У представників роду Bacillus діаметр спори не перебільшує шири­ни клітини (рис. 13, а) на відміну від представників роду Clostridium, у яких спора завжди ширша від поперечника вегетативної клітини (рис. 13,6).

За рахунок різкого зменшення вмісту води і переходу її у зв'язаний стан спори набувають стійкості до високої температури, а наявність у них двох щільних оболонок (екзин та інтин), просякнутих смолистими речовинами, надає стійкості проти інших фізико-хімічних та біоло­гічних факторів. Зокрема, спори стійкі проти багатьох дезінфікуючих розчинів, тривалий час переносять висушування, не чутливі до бактері­офагів та антибіотиків, можуть витримувати кип'ятіння від 15 хвилин до 3 годин і більше.

В одній вегетативній клітині бацил утворюється одна спора, на формування якої потрібно 18-20 годин. За сприятливих умов спора проростає (протягом 4—5 годин) і перетворюється в одну вегетативну форму бацили. Спори утворюють частіше паличкоподібні бактерії. У коків і звивистих бактерій цей процес спостерігається досить рідко.

Завдяки наявності щільних оболонок спори не фарбуються прости­ми методами і за Грамом. Для їх виявлення запропоновано спеціальні методи, основані на жорсткій дії на екзин гарячих розчинів барвни­ків зі спеціальними протравами, які розпушують оболонки спори й сприяють проникненню в неї барвника. Запропоновано кілька методів фарбування спор.

Метод Мюзареллі. На мазок, фіксований над полум'ям спиртівки, наносять метиленовий синій з бурою (до 100 мл 5 % водного розчину бури додають 3,3 г метиленового синього). Фарбують протягом 2 хв. з підігріванням до пароутворення. Залишок фарби зливають, препарат знебарвлюють 10 % водним розчином азотної кислоти протягом 10-20 с, потім ретельно промивають водою. На завершальному етапі його об­робляють 1 % водним розчином сафраніну або еозину протягом 1 хв, промивають водою й висушують. Мікроскопічна картина: спори — си­нього, тіла бацил - червоного кольору.

Метод Ожешко. 1. На кінці предметного скла готують товстий мазок, просушують і не фіксують.

2. Наносять 0,5 % розчин соляної кислоти (як протраву), підігріва­ють протягом 2 хв. до пароутворення.

3. Залишок кислоти зливають, препарат обережно промивають водою, підсушують і фіксують над полум'ям.

4. Препарат фарбують карболовим фуксином Ціля (див. додаток) з підігріванням до пароутворення.

5. Препарат знебарвлюють 5 % розчином сірчаної кислоти протягом декількох секунд, промивають водою.

6. Мазок дофарбовують метиленовим синім або малахітовим зеле­ним протягом 3-5 хвилин.

Мікроскопічна картина: спори після фарбування карболовим фук­сином витримують короткочасний вплив сірчаної кислоти і зберігають червоний колір, тоді як тіла бацил знебарвлюються цією кислотою і дофарбовуються в синій або зелений колір.

Лабораторне заняття 4. Фарбування капсул.

Мета. Оволодіти методикою виявлення капсул.

Матеріальне забезпечення. Світловий мікроскоп, спиртівка (газо­ва горілка), предметні скельця, бактеріологічні петлі, мікробна культу­ра (капсулоутворюючий вид, сапрофіт), набір фарб для пофарбування за Міхіним, Лефлером чи ін.

Бактерії деяких видів відкладають навколо своїх клітин шар слизо-подібних речовин, які утворюють капсулу. До складу останньої входять полісахариди, поліпептиди або мукополісахариди, які виконують захис­ну функцію. У патогенних бактерій капсула є фактором вірулентності, оскільки частіше утворюється в організмі уражених тварин. У сапрофітів

ця структура, як додаткова оболонка, виконує роль захисника від впливу несприятливих умов зовнішнього середовища.

Наявність капсули полегшує диференціацію деяких видів бакте­рій. Зокрема, з усіх представників роду Bacillus капсулу утворює лише Вас. anthracis, а серед клостридій - СІ. pcrfringens.

У зв'язку з особливостями хімічної структури, високою гідрофіль­ністю капсули погано сприймають звичайні розчини барвників, тому для їх вияву розроблено спеціальні методи.

Метод Романовського-Гімзи. Барвник Романовського-Гімзи ви­робляють у вигляді концентрату, до складу якого входить суміш азуру, еозину й метиленового синього (див. додаток). Для приготування ро­бочого розчину на 1 мл дистильованої води (pH 7,0-7,2) додають 1-2 краплі концентрату і відразу використовують.

Мазки краще фіксувати хімічним способом (метиловий спирт або суміш Никифорова). Після фіксації і висушування на мазок наносять робочий розчин фарби або вмішують препарати вертикально у склянку, наповнену цим розчином, де витримують в середньому годину, потім промивають дистильованою водою і висушують.

Мікроскопічна картина: мікробні клітини темно-синього кольору з фіолетовим відтінком, капсули блідо-рожеві, цитоплазма клітин патоло­гічного матеріалу блакитно-синього кольору, ядра фіолетово-червоні.

Метод Мі хіна. Мазки обережно фіксують над полум'ям. Наносять лужний розчин метиленового синього за Леффлером (див. додаток), нагрівають до пароутворення. Підтримують барвник гарячим протя­гом 5-7 хв. Мазки промивають, висушують фільтрувальним папером. Мікробні клітини набувають синього, а капсули - рожево-червоного кольору.

Метод Ольта. На фіксований мазок через фільтрувальний папір наносять гарячий 2 % розчин сафраніну й витримують 5-7 хв. Обережно промивають водою й висушують. Бактеріальні клітини фарбуються у червоно-коричневий, а капсули - у жовто-оранжевий колір.