Якщо на поверхню агарової культури нанести тоненький шар 1 % розчину перекису водню, по утворенню пухирців можна також визначити наявність каталази.

Визначення гемолітичних властивостей. Здатність мікроорганіз­мів руйнувати еритроцити крові називають гемолітичною активністю. Щоб визначити її, необхідно мікроорганізм посіяти на живильне середо­вище, яке містить еритроцити крові (наприклад, кров'яний агар).

Навколо колоній мікроорганізмів з гемолітичними властивостями утворюється прозора ф-гемоліз) або жовто-зелена (а-гемоліз) зона.

При наявності гемолізинів у висіяних бактерій рідке живильне се­редовище (МПБ з кров'ю) після інкубації робиться прозорим.

Tema 8. Визначення виду мікроорганізмів

Лабораторне заняття 1. Визначення виду мікроорганізмів традиційними та експрес-методами.

Мета. Ознайомити студентів з методикою визначення виду та ідентифікації мікроорганізмів

Матеріальне забезпечення. Методичні вказівки щодо визначення виду мікроорганізмів та відповідні посібники (Визначник бактерій Берджі та ін.). Попередньо складені завдання (умовні результати до­сліджень різноманітних властивостей мікроорганізму, необхідних для його ідентифікації).

Важливим для мікробіолога є питання видової належності об'єкта дослідження. Так, щоб поставити бактеріологічний діагноз інфекційного захворювання, слід ідентифікувати збудника.

Сучасна мікробіологія має достатній арсенал методів, щоб уже про­тягом кількох годин розпізнати значну кількість збудників інфекційних захворювань тварин і людини (експрес-методи діагностики: РІФ, ПЛР та ін). У той же час у нинішній ситуації ідентифікацію мікроорганізмів здійснюють переважно шляхом детального вивчення фенотипових його властивостей, зокрема: морфології, рухливості, ферментативних, антигенних та ін. З метою визначення мікроорганізмів було запропо­новано ряд посібників-визначників (Ціон, 1948; Красильников, 1949; Bergey,1923, 1936, 1974, 1984). Нині загальноприйнятим вважається останній. Це послідовно доповнений, змінений визначник американсько­го мікробіолога Bergey, перше видання якого вийшло у 1923 р. Дев'яте видання (1984 р.) - це результат праці понад 200 спеціалістів-мікро-біологів із різних країн світу, викладене у 4-х томах "Bergeys Manual of systematic Bacteriology" та коротке його видання "Bergeys Manual of determinative Bacteriology". Останнє перекладено на російську мову та видано масовим тиражем видавництвом "Мир" у 1997 р. (2 томи). Визначник Берджі призначений для ідентифікації бактерій за феноти-повими ознаками і містить концентровані дані щодо видів бактерій, переважно у формі таблиць визначення. Визначник Берджі містить лише незначну, найбільш актуальну для практики частину циркулюючих у природі мікроорганізмів. Визначник не побудований за філогенетичним принципом класифікації бактерій, яка поки-що неможлива. Він слугує лише ідентифікації бактерій.

Як користуватись визначником? Передусім треба уважно ознайо­митись з Передмовою, щоб збагнути суть і принцип, які автори видання взяли за основу при складанні визначника. Потім у главі 1 детально ознайомитись з методикою використання визначника. Звернути увагу на послідовність дій (6 етапів) мікробіолога, який збирається визна­чити вид виділеного мікроорганізму. На першому етапі пропонується ознайомитися зі схемами ідентифікації бактерій (гл. 2), на 2-му етапі визначитись належить мікроорганізм до прокаріотів чи еукаріотів (гл. 3), на третьому - визначається, до якої із 4-х запропонованих категорій на­лежить мікроорганізм (1 -грамнегативні еубактерії, що мають клітинну стінку, 2-га - грампозитивні еубактерії, що мають клітинну стінку, 3-тя - еубактерії, що не мають клітинної стінки, та 4-та - архебактерії (необхідні для цього ознаки дослідник знайде у гл. 4). На 4-му етапі досліднику слід звернутись до гл. 5 з тим, щоб уточнити, до якої групи належить мікроорганізм, що ідентифікується. На 5-му етапі визначається родова належність, а на 6-му - вид бактерії. Визначник містить велику кількість таблиць з диференційними ознаками, що робить його зручним під час ідентифікації мікроорганізму.

У зв'язку з сучасними досягненнями молекулярної генетики з'яви­лась змога ідентифікувати мікроорганізми без громіздкого вивчення їх фенотипових ознак, а шляхом визначення специфічних для певного виду нуклеотидних послідовностей у їх геномі, зокрема шляхом визначення нуклеотидних послідовностей 16 Б РНК. Користуючись останнім під­ходом, удається достовірно визначати родову приналежність мікроор­ганізму. При визначенні виду прийнято додатково визначати гомологію ДНК, використовуючи для цього типові штами.

Тема 9. Вплив біологічних факторів на бактерії

Лабораторне заняття 1. Знайомство з біологічними власти­востями бактеріофагів, методами їх виділення та титрування. Антибіотики, їх продуценти, практичне застосування. Мета. Ознайомити студентів з біологічними факторами, що

впливають на мікроорганізми, - бактеріофагами, антибіотичними

речовинами.

Матеріали та обладнання. Бактеріологічні чашки з МЛА, шпа­телі, пастерівські піпетки, набір дисків з різними антибіотиками, суспензія бактеріофагу (коліфаг чи ін.)

Бактеріофаги (фаги) - це віруси, що паразитують у бактеріях, зумовлюючи їх лізис, який називають бактеріофагією. Форма фагів переважно булавоподібна. У них розрізнюють гексагональну голівку діаметром близько 100 нм і хвостовий відросток, який закінчується особливими шипами, або виростами. В середині голівки знаходиться велика молекула ДНК й лише у деяких фагів - РНК.

Явище бактеріофагії високоспецифічне, тобто конкретний фаг здат­ний зумовити літичну дію відносно певного виду бактерій. Наприклад, сибірковий фаг паразитує лише в клітинах збудника сибірки і не може проникнути у клітини будь-якого іншого мікроба.

У природі фаги виявляють скрізь, де є відповідні бактерії, тому вони є індикатором їх присутності в досліджуваному середовищі. Фаги використовують у ветеринарії і медицині при лікуванні деяких хвороб (колібактеріоз, сальмонельоз телят і поросят, пулороз і тиф курей, дизен­терія, холера, черевний тиф людини). Враховуючи високу специфічність явища бактеріофагії, фаги використовують з метою визначення виду мікробних культур, діагностики ряду інфекційних хвороб, як санітарно-показові об'єкти. Наприклад, виявлення коліфага у питній воді свідчить про наявність у ній кишкової палички.

Виділення бактеріофагів. Декілька грамів (чи мілілітрів) дослі­джуваного матеріалу вносять у колбу з МПБ або іншим живильним середовищем й поміщають на 13-24 годин у термостат, який регулю­ють на оптимальну температуру росту мікроба того виду, проти якого передбачається виділити фаг. У живильному середовищі інтенсивно розмножуються бактерії, а в їхніх клітинах - фаги. Суміш фільтрують через бактеріальні фільтри. Одержаний фільтрат досліджують на на­явність у ньому фага двома методами.

1. У кілька пробірок з МПБ висівають тест-культуру, після чого в них вносять фільтрат у різних кількостях (0,1; 0,5 та 1,0 мл). У конт­рольну пробірку фільтрат не вносять. Посіви поміщають у термостат і через 6—13-24 годин враховують результат досліду. Якщо у фільтраті знаходиться відповідний фаг, то в пробірках ознаки росту культури бу­дуть відсутні. У контрольній пробірці спостерігатиметься помутніння й інші ознаки росту культури.

2. Тест-культуру засівають суцільним газоном на МПА у бактеріологічній чашці. На край чашки наносять велику краплю фільтрату й дають їй змогу стекти по поверхні МПА. Після 18-24-годинної інкубації у термостаті чашку розглядають проти джерела світла. При наявності у фільтраті фага утворюється так звана "фаго­ва доріжка" (за ходом краплі ріст культури відсутній; (рис. 30).

Титрування бактеріофагів: