• Матеріал повинен бути доставлений посильним.

• Тема 11. Серологічні методи дослідження у ветеринарній мікробіології

• Серед лабораторних методів дослідження фігурують бактеріоло­гічне, вірусологічне, празитологічне та ін. Серед останніх особливе значення має серологічне, що належить до групи імунологічних методів. За його допомогою можна ідентифікувати збудника, інколи визначати антигенну його характеристику (належність до певної серо-групи, серотипу); здійснювати ретроспективну діагностику. Остання базується на виявленні відповідних антитіл у сироватці крові (інколи важливо встановити і динаміку наростання їх титру).

• В основу серологічних досліджень покладено специфічну реак­цію між антигеном та антитілом. За допомогою серологічних реакцій можна виявити антиген або антитіло. У першому випадку необхідно мати специфічні антитіла, у другому - антигени.

• Антигенами називають генетично чужорідні речовини, які після введення в організм викликають реакцію у вигляді утворення специ­фічних антитіл. Антигени мають по кілька детермінантних рецепторів, за допомогою яких можуть вступати в реакцію з відповідними анти­тілами як в організмі тварин, так і за його межами (in vitro).

• Антитіла входять до імунних сироваток, тому останні є постійними компонентами серологічних реакцій (латинська назва сироватки - se­rum, звідси походить назва реакцій - серологічні).

• У мікробіологічній практиці широкого застосування набули сероло­гічні реакції: аглютинації, зв'язування комплементу, преципітації та ін.

• Лабораторне заняття 1. Реакція аглютинації.

• Мета. Ознайомити студентів із сутністю і проведенням реакції аглютинації.

• Матеріали і устаткування. Кювети, плексигласова панель із лун­ками, гумові груші, піпетки на 1 мл, фізіологічний розчин, позитивна си­роватка на бруцельоз, негативна сиворотка і антиген бруцельозний.

• Реакцію аглютинації (РА) застосовують з метою діагностики бруце­льозу, сальмонельозу, колібактеріозу, лістеріозу, вібріозу, лептоспірозу та інших захворювань. Існує кілька методів постановки РА: пробірковий (об'ємний), крапельний (пластинчастий), кров'яно-крапельний та ін.

• Щоб поставити РА, необхідно мати такі компоненти: антиген, досліджувану сироватку й фізіологічний розчин (0,85 % розчин на­трію хлориду на дистильованій воді). Антигеном в РА, як правило, є суспензія живих або знеживлених мікроорганізмів. Суспензію з живих мікроорганізмів готують змиванням фізіологічним розчином з поверхні МПА однодобової мікробної культури.

• Інактивовані антигени готують в умовах біологічної фабрики. Антигени повинні мати необхідну концентрацію мікробних тіл. Установлюють її за допомогою бактеріальних стандартів.

• Кров'яна сироватка повинна бути прозорою й свіжою, її одержують із крові методом відстою. Кров у великих тварин (корови, коні, верблю­ди) беруть з яремної вени, у свиней - із судин хвоста чи вушної раковини, птиці - із підкрильцевих судин у стерильні пробірки і залишають у теплі. Після утворення згустка роблять "обводку". Для цього профламбованим металевим стержнем верхню частину згустка відокремлюють від стінки пробірки. Після цього пробірки ставлять у холодильник (+4 °С). З по­явою достатньої кількості сироватки її відсмоктують у стерильні про­бірки. Для ідентифікації мікроорганізмів, ізольованих з патологічного матеріалу, застосовують стандартні сироватки, одержані на біологічних фабриках шляхом гіперімунізації тварин відповідними антигенами.

• Постановка РА класичним (пробірковим) методом. Досліджувані сироватки розводять у пробірках. При цьому користуються відповід­ними інструкціями. Так, при діагностиці бруцельозу сироватку крові великої рогатої худоби розводять у концентрації 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200, 1 :400, овець, кіз, свиней і собак - 1 : 25, 1 : 50, 1 : 100 та 1 : 200 (див. табл. 5).

• Розливання сироватки мікропіпеткою

• Доза	Антиген, розведений до	Розведення
  сироватки	500 млн мікробних тіл в 1 мл	сироватки
  0,04	1	1 : 25
  0,02	1	1 : 50
  0,01	1	1 : 100
  0,005	1	1 :200

• Розведення зручно здійснювати таким чином. Спочатку готують основне розведення (1 : 50 сироватки крові великих тварин і 1 : 25 - дріб­них). Щоб одержати розведення 1 : 50, беруть 0,1 мл сироватки і змішу­ють її з 4,9 мл фізіологічного розчину.

• У штатив ставлять чотири пробірки (для кожної досліджуваної си­роватки) і в три (крім першої) вносять по 0,5 мл фізіологічного розчину. Потім у першу і другу пробірки вносять по 0,5 мл основного розведення досліджуваної сироватки. З другої пробірки 0,5 мл переносять у третю, з третьої - у четверту, з четвертої 0,5 мл розчину видаляють. Таким чи­ном одержують розведення 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 та 1 : 400. Після цього в усі пробірки вносять по 0,5 мл стандартного бруцельозного антигену, доводять фізіологічним розчином до робочого титру. Вміст пробірок змішують і залишають протягом 4-6 годин в умовах термостату при тем­пературі 37 °С, а потім - на 14-16 годин при кімнатній температурі.

• При масових дослідженнях сироватки крові свиней, овець, кіз і со­бак допускається постановка реакції у двох перших розведеннях, тобто 1 : 25, 1 : 50. При дослідженні сироватки крові великої рогатої худоби, верблюдів - 1 : 50 та 1 : 100.

• При постановці реакції аглютинації ставлять такі контролі:

• 0,5 мл фізіологічного розчину +0,5 мл антигену - для виключення самоаглютинації;

• контроль сироватки крові, яка не містить антитіл проти збудника бруцельозу;

• контроль сироватки, яка містить антитіла проти збудника бру­цельозу.

• Контрольні сироватки досліджують у тих же розведеннях, що й основні. Дози антигену при цьому аналогічні. Результати постановки реакції аглютинації спостерігають неозброєним оком або користують­ся аглютиніноскопом. Спочатку розглядають контрольні пробірки. Результати РА записують за допомогою умовних позначень (+) та (-).

• (+ + + +)- повне прояснення вмісту пробірки, парасолька сформо­вана чітко. При струшуванні пробірки осад розбивається на пластівці;

• (+++) - неповне прояснення вмісту пробірки. Осад такий же, як і в першому випадку;

• (++) - прояснення вмісту пробірки слабке, парасолька сформована недостатньо;

• (+) — рідина каламутна, на дні пробірки - пластівці;

• (-) - рідина каламутна, осад у вигляді ґудзика. При легкому стру­шуванні пробірки він зумовлює рівномірне помутніння всього вмісту пробірки.

• Досліджувану сироватку вважають позитивною, якщо вона зумов­лює аглютинацію з оцінкою не менше двох хрестів у розведенні 1 : 100 і вище (велика рогата худоба, коні, верблюди) й 1 : 50 і вище (собаки, вівці, свині, кози). При одержанні сумнівних результатів кров у тварин беруть через 3-4 тижні й дослідження повторюють.

• Крапельний (пластинчастий) метод РА застосовують з метою швидкої орієнтувальної ідентифікації збудника чи антитіл у кров'яній сироватці.

• При ідентифікації збудника реакцію ставлять таким чином. У центр предметного скла наносять краплю стандартної аглютинуючої сироват­ки у розведенні 1 : 50, на лівий край - краплю сироватки у розведенні 1 : 20, на правий - краплю фізіологічного розчину. У кожну краплю бактеріологічною петлею додають невелику кількість досліджуваної (агарової) культури і рівномірно розмішують. Результат спостерігають через 2-3 хвилини.

• При позитивній реакції у краплі з аглютинуючою сироваткою з'являються пластівці, крупинки. Рідина стає прозорою. У контрольних краплях остання залишається каламутною, а пластівці й крупинки не утворюються. Реакцію краще роздивлятись на темному фоні.

• При виявленні антитіл у сироватці спочатку готують різні її роз­ведення і наносять мікропіпеткою на предметне скло. Потім вносять антиген, змішують скляною паличкою (починаючи з найбільшого роз­ведення сироватки) і враховують результат.

• Кров'яно-крапельний метод РА найчастіше застосовують з метою діагностики пулорозу (сальмонельозу) птиці. На знежирене предметне скло наносять краплю крові (з гребеня чи сережки), вносять антиген, змішують скляною паличкою. Щоб краще спостерігати феномен аглю­тинації, користуються пофарбованим антигеном. У позитивних випад­ках РА у краплі з'являються пластівці та крупинки (аглютинат).

• Реакцію аглютинації з молоком ставлять при обстеженні великої рогатої худоби на бруцельоз. У пробірки наливають по 2-3 мл дослі­джуваного молока і вносять по 0,2 мл антигену (забарвленого гема-токсилінеозином). Пробірки струшують до рівномірного забарвлення молока і лишають у термостаті або витримують на водяній бані про­тягом 45-60 хв. при температурі 37 °С.

• При наявності у молоці антитіл утворюється комплекс анти­ген - антитіло, який адсорбується на краплинах жиру. Останні при відстоюванні спливають догори, утворюючи синє кільце у нижньому шарі вершків. Стовпчик молока знебарвлюється. Негативна реакція характеризується синім забарвленням усієї проби молока та жовтуватим кольором вершків.

• Лабораторне заняття 2. Реакція преципітації.

• Мета. Викладач коротко пояснює суть реакції преципітації при діаностиці сибірки. Ознайомлює класичним та пластинчастим мето­дами постановки РА.

• Обладнання і реактиви. Простерилізовані шматки досліджува­них шкір, ножиці, бактеріологічні чашки, пробірки звичайні, пробірки Уленчута, карболізований фізіологічний розчин, позитивна сибіркова прецепітуюча сироватка, позитивний сибірковий антиген, воронки з азбестовою ватою, спиртівки.

• Реакція преципітації (РП) основана на тому, що при взаємодії антигену (преципітиноген) зі специфічним антитілом (преципітин) утво­рюється преципітат (осад). РП застосовують у ветеринарній практиці переважно при дослідженні шкіряної сировини на сибірку.

• Дослідження шкіряної сировини на сибірку за допомогою РП. У лабораторію надсилають проби шкіри будь-якої характеристики. їх відбирають у вигляді невеликих (4 х 4 см) квадратиків або кружечків. Якщо проб багато, їх нанизують на тонкий дріт у порядку, що відповідає порядку сировини на складі.

• Проби від парної й мороженої сировини витримують для нагрома­дження антигену протягом двох діб при температурі не нижче 20 °С. Решту проб досліджують відразу після надходження в лабораторію.

• Порядок дослідження такий.

1. Стерилізація проб в автоклаві з метою знищення збудника (1,5 атм протягом ЗО хв. або 1 атм протягом 1 години).

2. Подрібнення проб здійснюють ручним (ножиці) або механічним способом. Від кожної проби нарізають невеличкі шматочки загальною масою 1 г і кладуть у скляні 50-мілілітрові банки. Від кожної проби мокросоленої сировини нарізають 2 г і кладуть в окремі банки.

3. Екстракція проб. При дослідженні парної, мороженої, прісно-сухої та сухосоленої сировини використовують карболізований 0,85 % розчин натрію хлориду, при дослідженні мокросоленої сировини - дис­тильовану воду з доданням 0,3 % карболової кислоти.

• Мокросолені проби заливають 7-8 мл екстрагуючої рідини, решту проб - 10 мл. Вміст банок ретельно розмішують й екстрагують холодним способом (16-20 годин при кімнатній температурі). Проби свинячих шкір екстрагують гарячим способом.

4. Фільтрування екстракту. Застосовують азбестову вату, попере­дньо перевірену на рН (нейтральний).

5. Постановка РП. Стандартна протисибіркова преципітуюча си­роватка повинна бути абсолютно прозорою. Для цього її відстоюють і видаляють верхній прозорий шар або фільтрують через азбестову вату. При дослідженні сухосоленої чи мокросоленої сировини до сироватки додають 3-4 % (інколи 5 %) хімічно чистого КаСІ. Сироватку пере­віряють на активність та специфічність (зі стандартним сибірковим антигеном реакція повинна бути позитивною, а з екстрактом вільної від сибіркового антигену шкіри - негативною). Реакцію ставлять мето­дом нашарування екстракту на сироватку. Користуються апаратурою Флоринського (на 0,25-0,3 мл сироватки нашаровують 0,25-0,3 мл екстракту і залишають при кімнатній температурі).

• 6. Врахування результату постановки реакції. При дослідженні мороженої та прісносухої сировини результат реакції фіксують в пері- од з 10-ї по 15-ту хв. від моменту постановки реакції, при дослідженні сухосоленої - через 30 хв., мокросоленої - через 1 годину. При вияв- ленні характерного сірувато-білого диска на межі компонентів реакцію вважають позитивною.

• Реакція дифузійної преципітації (РДП). Метод простої дифузії за Оуденом застосовують шляхом нашаровування антигену на поверхню агару, який містить специфічну сироватку. Ставлячи реакцію за методом Аухтерлоні, сироватку вносять у спеціальні лунки, зроблені в агарі, що містить антиген.

• Найчастіше застосовують метод подвійної дифузії. У бактеріологіч­ні чашки наливають розплавлений агар. Після його застигання вирізають кілька лунок, користуючись спеціальним пристосуванням. У централь­ну лунку вносять сироватку, що містить відповідні антитіла, в решту лунок - досліджувані антигени або один антиген у різних розведеннях. Чашки ставлять в ексикатор чи термостат. Результат враховують, аналі­зуючи стан агарової пластинки між лунками з сироваткою й антигеном. У позитивних випадках на місці контакту антигенів та антитіл утворю­ється молочно-біла лінія преципітату. Якщо антигени ідентичні, зони їх дифузії з'єднуються і при контакті з зоною дифузії антитіла утворюють загальну дугоподібну лінію преципітації. Щоб запобігти утворенню псевдопреципітатів, необхідно брати очищені антигени.

• Існує кілька модифікацій постановки РДП. Крім описаного, часто застосовують капілярний мікрометод, що характеризується високою чутливістю й економічністю, а також значним скороченням часу до­слідження.

• Реакція флокуляції дає змогу визначити токсичність досліджу­ваних бактерій за допомогою антитоксичних сироваток. У пробірки, що містять по 10 мл певного токсину, вносять специфічну сироватку у різних кількостях (1,0; 0,9; 0,8 ... 0,3 і т. д.). Пробірки струшують, залишають при кімнатній температурі, а через деякий час у них спо­стерігають опалесценцію, яка переходить у виразне помутніння. Потім утворюються пластівці й випадає осад. Флокуляція спочатку з'являється в окремих пробірках, потім - у решті, будучи показником еквівалентності антигену (токсину) й антитіла (антитоксину), при якому відбувається взаємодія антигену з антитілом (токсину з анти­токсином), повна нейтралізація токсину. У пробірках, де не досягнуто повного насичення, флокуляція настає пізніше.

• Реакцію нейтралізації (РН) (за Ерліхом з біопробою) викорис­товують для визначення видової належності бактеріальних токсинів у досліджуваному матеріалі та активності антитоксичної сироватки. У вірусології її застосовують для ідентифікації деяких вірусів або відпо­відних антитіл.

• У пробірки з однаковою кількістю антигену в 1 мл (наприклад, 1000 смертельних доз токсину правцю) вносять такий же об'єм специфічної протиправцевої антитоксичної сироватки, поступово зменшуючи її концентрацію. Суміш токсин - антитоксин ставлять у термостат на 1-2 години, потім вміст кожної пробірки вводять лабораторним тваринам (з розрахунку одне розведення на дві тварини). Організми, які одержали суміш, де відбулась нейтралізація токсину, виживають, решта - гинуть. Найменшу кількість сироватки, яка нейтралізує токсин, приймають за одиницю активності антитоксичної сироватки (АО).

• Імуноелектрофорез. Дослідження проводять у два етапи: електро­форетичне розділення досліджуваного матеріалу в агарі; імунологічний аналіз. В агарі паралельно осі міграції електрофоретичних функцій роблять невеликі траншеї, куди вносять імунну сироватку, що містить антитіла до досліджуваних антигенів. У разі реакції між антигенами й антитілами формується преципітат у вигляді дискретних дуг, що відпо­відають індивідуальним системам антиген — антитіло.

• Метод флуоресціюючих антитіл (МФА). Реакція імунофлуорес-ценції (РІФ). Індикація бактеріальних і вірусних антигенів у інфікова­них матеріалах, тканинах тварин та клітинних культурах за допомогою флуоресціюючих антитіл (сироваток) набула значного поширення в діа­гностичній практиці. Імунофлуоресцентний метод належить до методів експрес-діагностики. За чутливістю і специфічністю він не поступається іншим серологічним реакціям.

• У РІФ використовують антитіла, до яких спеціальним методом при­єднано флуорохром (частіше флуоресцеїн - ізотіоціанат). Такі антитіла зберігають здатність специфічно реагувати з антигеном і завдяки наяв­ності флуорохрому світитись під дією ультрафіолетових променів.

• Принцип методу визначення антигенів за допомогою флуоресці­юючих антигенів зводиться до того, що помічені флуорохромом антитіла адсорбуються на поверхні відповідних антигенів і міцно з ними зв'язуються. Якщо антиген (гетерологічний) не відповідає поміченим антитілам, що знаходяться у сироватці, то останні легко видаляються при промиванні препарату.

• Приготування препаратів. Об'єктами дослідження можуть бути мазки-відбитки, гістозрізи з уражених тканин, а також препарати з інфікованих курячих ембріонів, клітинних культур. Предметні стекла повинні бути чистими, знежиреними, без подряпин і інших пошкоджень. Препарат (з досліджуваним матеріалом) підсушують на повітрі і фіксу­ють ацетоном (5 хвилин) або ж етанолом (10-15 хвилин) чи метанолом (5-10 хвилин). Фіксацію здійснюють також шляхом нагрівання препара­ту над полум'ям спиртівки (як і при звичайній мікроскопії). Зафіксовані препарати зберігаються досить довго.

• Є кілька методів реакції імунофлуоресценції.

• Прямий метод РІФ. На предметне скло з фіксованим антигеном на­носять краплю люмінесціюючої імунної сироватки, яка містить антитіла проти відповідного антигену. Препарати поміщають у вологу камеру (бактеріологічні чашки із змоченим ватним тампоном чи фільтрувальним папером) й витримують у термостаті при температурі 37 °С протягом 15-30 хвилин. Потім протягом 5-10 хвилин їх промивають у проточній воді, щоб видалити надлишки сироватки або 0,15 М розчином хлорис­того натрію у фосфатному 0,01 М буфері.

• Промитий препарат висушують фільтрувальним папером і мікроско­пують. Специфічний об'єкт буде світитись у темному полі зору мікро­скопа. Цим методом користуються лише для ідентифікації невідомого антигену. Недоліком його є необхідність приготування люмінесціюючої сироватки для кожного виду ідентифікованого мікроорганізма.

• Непрямий метод РІФ. Порівняно з описаним вище методом цей універсальніший, тому що за допомогою однієї універсальної сиро­ватки можна виявити різні види мікроорганізмів. Метод двоетапний. На першому етапі на фіксований препарат наносять краплю імунної, не поміченої сироватки, специфічної до передбачуваного антигену, і ставлять у термостат на 15-20 хвилин (в умовах вологої камери). Потім промивають водою або буферним розчином. Антитіла, які відповідають антигену, що є у препараті, не відмиваються.

• На другому етапі на препарат наносять краплю антивидової люмінесці­юючої сироватки, що містить антитіла проти глобулінів першої сироватки і знову поміщають у термостат в умовах вологої камери на 15—20 хвилин. Після цього препарат промивають, висушують і мікроскопують.

• Антивидова сироватка - це помічені флуорохромом антитіла проти глобулінів крові тих тварин, від яких одержано імунну сироватку до перед­бачуваного антигену. Таким чином, антитіла першої (не поміченої) сироват­ки є антигеном для помічених антитіл антивидової сироватки. В результаті до комплексу антиген - антитіло, що утворився на першому етапі реакції, приєднуються антитіла антивидові, тобто утворюється подвійний комплекс, який можна виявити за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

• Антикомплементарний (трикомпонентний) варіант. На предметне скло з досліджуваним матеріалом наносять краплю імунної не поміченої сироватки першого ступеня. Препарат ставлять у термостат, підсушують і на мазок наносять краплю комплементу. Після цього препарат знову ставлять у термостат на 15-20 хвилин, промивають і наносять люмінес­ціюючу антикомплементарну сироватку. Описані процедури аналогічні тим, які виконують при прямому (одноступінчастому) варіанті.

• Для підтвердження специфічності результатів необхідно ставити такі контролі: для прямого варіанта люмінесцентною сироваткою за­барвлюють гомологічні й гетерологічні в антигенному відношенні мікроорганізми. Світитись бактерії повинні лише у першому випадку.

• Для непрямого варіанта необхідно мати три контрольних препарати, оброблені: нормальною сироваткою, люмінесцентною антивидовою сироваткою (без імунної, не поміченої сироватки) та люмінесціюючою антивидовою сироваткою і завчасно відомою імунною сироваткою пер­шого етапу. Специфічне світіння бактерій повинно бути спостерігатись у третьому контролі.

• Для непрямого варіанта з комплементом обов'язковими контроль­ними препаратами є ті, у яких імунну сироватку заміщено нормальною сироваткою того ж виду тварини й у тих же розведеннях, а також пре­парати, оброблені усіма інгредієнтами, крім імунної сироватки.

• При оцінці результатів необхідно враховувати яскравість і колір, локалізацію й структуру об'єкта, що світиться. Бактерії, забарвлені люмінесціюючою сироваткою, поміченою ізотіоціанатом флуоресцеїну, яскраво світяться зеленим кольором по периферії у вигляді кайми чи ореолу. Центральна частина бактерій освітлена слабко. Таке світіння називають специфічним (на відміну від неспецифічного, коли вся мі­кробна клітина світиться рівномірно). Пластичні бактерії (лептоспіри, вібріони) світяться рівномірно.

• Інтенсивність світіння оцінюють за такою системою:

• (+ + + +)- дуже яскрава флуоресценція по периферії мікробної клітини, яка чітко контрастує з темним тілом клітини;

• (+ + +)- яскрава флуоресценція по периферії клітини;

• (+ +) - слабке світіння по периферії клітини;

• (+) - ледь помітне світіння по периферії;

• (-) - світіння по периферії клітини відсутнє.

• При ідентифікації різних збудників позитивним результатом вважа­ють специфічне світіння бактеріальних клітин за умови (+ + + ).

• Лабораторне заняття 3. Реакція зв'язування комплементу.

• Мета роботи. Ознайомити студентів із використанням РЗК у ветеринарній практиці, освоїти техніку її постановки.

• Обладнання і устаткування. Фізіологічний розчин; 2,5 % суспензія еритроцитів барана у фізіологічному розчині, бруцельозний антиген, позитивна бруцельозна сироватка, нормальна сироватка великої рога­тої худоби, комплемент морської свинки, гемолізин, мірні піпетки на 1-2 мл, водяна баня.

• Реакцію зв'язування комплементу (РЗК) вперше описали Борде і Жангу у 1901 р. В основі реакції лежать два явища - бактеріоліз та гемоліз. У прояві цих явищ бере участь комплемент.

• Реакція утворення комплексу антиген - антитіло - комплемент невидима. Щоб виявити взаємодію компонентів, використовують до­даткову індикаторну систему, яка відображає результат взаємодії у пер­шій системі. Таким чином, РЗК передбачає використання двох систем: бактеріолітичної та гемолітичної.

• РЗК здійснюють у два етапи. Спочатку готують бактеріолітичну систему. У пробірках змішують по 0,5 мл досліджуваної інактивованої сироватки з антигеном, додають комплемент у чітко визначеній кіль­кості.

• Суміш антиген - антитіло (сироватка) - комплемент (бактеріолі-тична система) поміщають на водяну баню (термостат) при температурі 37-38 °С на 20^40 хвилин. Результат взаємодії компонентів у пробірці невидимий, рідина залишається прозорою і безбарвною. Щоб визначи­ти, зв'язався комплемент у бактеріолітичній системі чи ні, необхідний другий етап реакції. Для цього у пробірки вносять компоненти гемолі­тичної системи (відмиті еритроцити барана та інактивовану гемолітичну сироватку) й знову ставлять на водяну баню на 15-20 хвилин.

• Враховують попередній результат — наявність чи відсутність гемо­лізу, залишають пробірки при кімнатній температурі на 18-20 годин і враховують остаточний результат.

• Якщо сироватку одержано з крові хворої тварини, то в ній є антитіла, які з'єднуються з відповідним антигеном. З комплексом антиген - ан­титіло зв'язується комплемент. Відсутність останнього не призведе до гемолізу еритроцитів в індикаторній системі, що свідчить про позитив­ний результат постановки реакції.

• Якщо сироватку одержано з крові здорової тварини, то вона антитіл не містить, комплекс антитіло - антиген не утворюється, комплемент у бактеріологічній системі не зв'язується. При внесенні у пробірку еритроцитів та гемолізину відбудеться гемоліз. Результат постановки реакції в такому випадку вважають негативним.

• РЗК використовують для визначення наявності у сироватці кро­ві хворої тварини специфічних антитіл (при діагностиці бруцельозу, перипнсвмонії, сапу, лептоспірозу та ін.), вияву у досліджуваному ма­теріалі специфічного антигену (бактеріальний, вірусний) при наявності специфічної імунної сироватки.

• Для постановки РЗК потрібно такі компоненти: проби сироваток з крові тварин, направлених на дослідження, дві позитивні проби си­роваток крові (стандартні, гіперімунні, які забезпечують позитивний результат - для контролю) та дві проби сироваток з крові здорових тварин - також для контролю (усі сироватки в розведенні 1:10 інакти-вують з метою руйнування їх власного комплементу прогріванням на водяній бані при температурі 56-58 °С протягом ЗО хвилин); антиген у розведенні відповідно до титру (зазначеного на упаковці); комплемент-сироватка крові морської свинки (у розведенні відповідно до встановле­ного титру); гемолізин у робочому титрі; суспензія еритроцитів барана у розведенні 1 : 40; фізіологічний розчин.

• Сироватки, що надійшли для дослідження, та контрольні (пози­тивні, нормальні) розводять фізіологічним розчином у співвідношенні 1 : 5 або 1 : 10, інактивують на водяній бані при температурі 56-58 °С протягом 30 хв. (сироватки крові ослів, мулів, лошаків інактивують при температурі 61 °С протягом 30 хвилин).

• Антиген для РЗК готують на біофабриках. Як правило, це екстра­кти із зруйнованих бактерій або інфікованих ними тканин. Антигени не повинні викликати гемолізу еритроцитів, що контролюється під час постановки реакції (у пробірку вносять 1-2 робочі дози антигену й 0,5 мл суспензії еритроцитів). На упаковці антигену зазначено номер серії, контроль, дату виготовлення, строк придатності, активність, тобто у якому розведенні його слід використовувати при постановці реакції - 1 : 100, 1 : 150 і т. д. При тривалому зберіганні робочий титр антигену встановлюють у лабораторії шляхом титрування.

• Гемолізин готують на біофабриках гіперімунізацією кролів відми­тими еритроцитами крові барана. Кролям внутрішньовенно 5-6 разів із 2-3 добовими інтервалами вводять 40-50 % суспензію відмитих ери­троцитів. Через тиждень після останньої ін'єкції у тварин беруть кров. Після утворення та ретракції згустка асептично відсмоктують сироват­ку, інактивують її, консервують гліцерином (1:1) або 0,5 % фенолом, титрують, розливають в ампули. У лабораторії перед постановкою РЗК гемолізин титрують знову.

• Схема титрування гемолізину. Останній розводять у співвідно­шенні 1 : 100 (0,2 мл гемолізину, консервованого гліцерином +9,8 мл фізрозчину). Крім того, потрібні: комплемент - 1 : 20, суспензія еритро­цитів крові барана - 1 : 40, фізіологічний розчин N301.

• У штативі розміщують два ряди пробірок - один для приготуван­ня розведень гемолізину, другий - для титрування. У першу пробірку вносять вихідне розведення гемолізину - 1 : 100, потім здійснюють послідовні розведення (рис. 36).

• З кожної пробірки відповідного розведення гемолізину в окрему пробірку переносять по 0,5 мл. В усі пробірки другого ряду вносять по 0,5 мл комплементу та суспензії еритроцитів і по 1 мл фізрозчину, щоб загальний об'єм рідини досягав 2,5 мл. Усі пробірки легенько струшують і ставлять на водяну баню при температурі 37-38 °С на 10-15 хвилин. Результати титрування починають враховувати у пробірках з най­більшою кількістю гемолізину (1 : 500, 1 : 1000). У пробірці з наймен­шою кількістю гемолізину, де відбудеться повний гемоліз еритроцитів, буде його граничний (фактичний) титр. В даному випадку фактичний титр гемолізину становить 1 : 2000.

• Для наступної роботи (титрування комплементу, головний дослід РЗК) гемолізин використовують у подвоєному титрі (робочий титр). У наведеному прикладі фактичний титр гемолізину становить 1 : 2000, робочий - 1 : 1000, тобто при постановці РЗК відтитрований гемолізин потрібно розвести фізіологічним розчином у співвідношенні 1 : 1000 (1 мл гемолізину й 1000 мл фізіологічного розчину).

• Комплемент відкрито Бухнером (1889). Він має білкову природу. Інактивується при нагріванні до 56 °С протягом 30 хв. під дією ультрафі­олетових променів, хімічних речовин (кислоти, луги, ацетон, хлороформ тощо), струшуванні.

• Біологічна промисловість випускає комплемент, консервований ви­сушуванням. Одержують його з крові морських свинок. Ліофілізовавий комплемент зберігається два роки. Перед кожною постановкою РЗК комплемент титрують, тобто визначають його робочу дозу - найменшу кількість, яка зумовлюює повний гемоліз еритроцитів крові барана в стандартних умовах постановки РЗК.

• Комплемент титрують у гемолітичній та бактеріолітичній системах.

• Для титрування комплементу у гемолітичній системі готують компоненти: комплемент у розведенні 1 : 20 (1 мл комплементу+18 мл фізіологічного розчину), гемолізин, розведений відповідно до робочого титру, суспензію відмитих еритроцитів крові барана (1 : 40), фізіоло­гічний розчин. У пробірки, поставлені в один ряд у штатив, градуйо­ваною піпеткою розливають різну кількість комплементу, збільшуючи дозу на 0,03 мл (0,13; 0,16; 0,19; від 0,22 до 0,43). Потім у ці самі про­бірки вносять фізіологічний розчин у кількості, що становить разом з комплементом 0,5 мл, тобто у першу - 0,37, у наступні - 0,34; 0,31; 0,28 і т. д. Після цього в усі пробірки вносять по 0,5 мл гемолізину та еритроцитів крові барана і по 0,1 мл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і ставлять на водяну баню на 10-15 хв. при температурі 37-38 °С. Враховують результат (рис. 37).

• При титруванні комплементу та гемолі­зину (всю роботу - від титрування комплементу до постановки основного досліду РЗК - здійсню­ють протягом одного дня) ставлять контроль, кожний компонент у окремій пробірці - 0,5 мл гемолізину у робочому титрі+0,5 мл суспензії еритроцитів+1,5 мл фізіологічного розчину; 0,5 мл комплементу 1 : 20 + 0,5 мл еритроцитів +1,5 мл фізіологічного розчину. Пробірки струшують і ставлять на водяну баню. У контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.

• Схема титрування комплементу у бактеріолітичній системі. Готують комплемент (1 : 20), суспензію еритроцитів крові барана (1 : 40), гемолізин у робочому титрі й дві позитивні та дві нормальні проби сироватки, специфічний антиген (у титрі, зазначеному на етикетці). Сироватку (1 : 10) інактивують при температурі 56-58 °С протягом ЗО хв. Кожну пробу сироватки розливають у два ряди пробірок по 0,5 мл і вносять комплемент у зростаючій кількості, починаючи з дози його титру в гемолітичній системі. У наступні пробірки вносять комплемент, щоразу збільшуючи його дозу на 0,03 мл (як і при титруванні компле­менту у гемосистемі). Додаючи фізрозчин, вирівнюють об'єм вмісту пробірок (до 0,5 мл). У пробірки одного ряду кожної проби сироватки (позитивні й нормальні) додають по 0,5 мл антигену, другого ряду - по 0,5 мл фізрозчину. Всі пробірки струшують і ставлять на водяну баню при 37-38 °С на 30-40 хвилин, після чого в кожну з них вносять по 0,5 мл гемолізину і суспензії еритроцитів, струшують і повторно ставлять на водяну баню на 10-15 хв. Враховують результат титрування, починаючи з пробірок другого ряду кожної проби сироватки (без антигену) і проб нормальної сироватки з антигеном (перший ряд). У цих пробірках слід чекати повного гемолізу, враховуючи лише найменшу кількість комп­лементу, що зумовив цей гемоліз за умови, що у перших рядах пробірок з позитивними сироватками й антигеном з такою ж дозою комплементу буде повна затримка (відсутність) гемолізу. Найменшу кількість комп­лементу, що забезпечує повний гемоліз в нормальній сироватці з анти­геном і без нього, при повній затримці його в позитивній сироватці з антигеном, називають титром комплементу у бактеріолітичній системі. У цьому титрі використовують комплемент при постановці РЗК з діа­гностичною метою.

• Постановка головного досліду РЗК (діагностичне дослідження). У штативи ставлять два ряди пробірок (згідно з кількістю проб сироваток досліджуваної крові). Кожну пробу інактивованої сироватки (1 : 10) вносять в обидві пробірки по 0,5 мл. У першу пробірку додають специ­фічний антиген (0,5 мл), у другу - фізрозчин без антигену (0,5 мл). Потім в усі пробірки (першого й другого рядів) вносять комплемент (по 0,5 мл), легенько струшують і ставлять на водяну баню на 20-40 хв. при темпера­турі 37-38 °С. Це-бактерюлітична система. Після витримування на водяній бані в усі пробірки вносять ком­поненти гемолітичної системи - гемолізин та суспензію еритроцитів крові барана (по 0,5 мл кожного), струшують, повторно ставлять на водяну баню на 15— 20 хв. Для будь-якої кількості проб дослі­джуваних сироваток як контроль використо­вують позитивну (дає позитивний результат) і нормальну (дає не­гативний результат) сироватки (рис. 38).

• Результат враховують двічі: вперше - відразу після виймання з водяної бані, вдруге - через 18-20 годин відстоювання у пробірках при кімнатній температурі. Під час попереднього аналізу звертають увагу на пробірки другого ряду й пробірки з нормальною сироваткою та анти­геном, де має відбутися гемоліз. У пробірках з позитивною сироваткою і антигеном спостерігають відсутність гемолізу (еритроцити зумовлюють рівномірне помутніння вмісту пробірки). Заключний аналіз свідчить про те, що у пробірках, де раніш відмічався повний гемоліз еритроцитів, ніяких змін не відбулось, а у пробірках, де гемоліз не спостерігався, ери­троцити мають вигляд осаду. Рідина над осадом прозора й безбарвна.

• Показники реакції вважають достовірними, якщо у пробірках з позитивною сироваткою та антигеном гемоліз відсутній при повному гемолізі еритроцитів у пробірках з позитивною сироваткою без антигену і в усіх пробірках з нормальною сироваткою.

• РЗК передбачає контроль антигену, комплементу, гемолізину, ери­троцитів. Для цього в окремі пробірки вносять антиген з еритроцитами крові барана, комплемент з еритроцитами крові барана, комплемент без гемолізину, гемолізин з еритроцитами без комплементу, еритроцити й фізіологічний розчин. Об'єм вмісту кожної пробірки доводять фізіоло­гічним розчином до 2,5 мл. Пробірки струшують, ставлять на водяну баню при температурі 37 °С на 20 хв. В усіх контрольних пробірках гемолізу не повинно бути.

• Результат РЗК виражають за допомогою умовних позначень залеж­но від ступеня його інтенсивності: (++++) - повна затримка гемолізу (результат позитивний); (+++) — чітко виражена затримка гемолізу, є значний осад еритроцитів, рідина над ним слабко-рожевого кольору (результат позитивний), (++) - часткова затримка гемолізу, спостері­гається компактний осад еритроцитів, рідина має яскраве червоне за­барвлення (результат сумнівний); (+) - слабка затримка гемолізу, осад незначний, рідина інтенсивно забарвлена у червоний колір (результат негативний); (-) - повний гемоліз ("лакова кров"), осад відсутній (ре­зультат негативний).

• РЗК використовують з метою вияву у сироватці крові хворої тва­рини специфічних антитіл (діагностика бруцельозу, сапу, лептоспірозу тощо) та специфічного антигену (бактеріальний або вірусний) у різних матеріалах за допомогою специфічних імуносироваток.

• Реакцію тривалого зв'язування комплементу (РТЗК) запропоновано Якобшином (1910). Суть її полягає у тому, що бактеріолітичну систему витримують у трьох температурних режимах: після змішування компо­нентів - при кімнатній температурі протягом 15 хв., при температурі 4 °С (у холодильнику) протягом 13-18 годин, після чого підігрівають протягом 15 хв. на водяній бані (37 °С) і вносять гемолітичну систему. Залишають, як і при постановці РЗК, на водяній бані і враховують ре­зультати реакції. РТЗК вважають більш "чутливою". її рекомендовано для діагностики туберкульозу, кампілобактеріозу, бруцельозу та ін.

19