Мікроскопія

Об'єктами дослідження мікробіологічних лабораторій є бактерії (у широкому розумінні цього поняття) та гриби (якщо в лабораторії не існує відповідного відділу). Основними методами дослідження є мікроскопічний - виявлення та описання морфології об'єкта за допо­могою мікроскопічної техніки; бактеріологічний (мікологічний) - ізо­ляція мікроорганізму на живильному середовищі та його ідентифікація. Останнє здійснюють частіше на основі вивчення цілого ряду згаданих вище властивостей, інколи додатково користуються імунологічними (се­рологічними) методами. На основі мікроскопічного дослідження інколи можна ставити попередній діагноз та пропонувати здійснювати необхід­ні заходи у господарстві, з якого надійшов матеріал (наприклад, при си­бірці). Проте частіше мікроскопія дозволяє лише виявити мікроорганізм, зорієнтуватись, певною мірою, у напрямі подальшого дослідження (посів на певні живильні середовища, зараження лабораторних тварин тощо) та застосовується як перший етап бактеріологічного методу. Виділення, ідентифікація та визначення патогенних властивостей збудника є класичним варіантом бактеріологічного дослідження, застосовується протягом тривалого часу і, очевидно, залишиться визначальним діа­гностичним методом. Проте його недоліком є недостатня оперативність, затрата різних матеріалів, небезпека зараження тощо. У ході здійснення пошуків оперативнішої діагностики (ідентифікації) захворювань були запропоновані методи виявлення збудників (антигенів) безпосередньо у нативному матеріалі за допомогою імунофлуоресцентного методу, гістохімічної варіанти імуноферментного аналізу, а також розроблені молекулярно-генетичні методи їх індикації шляхом "розпізнавання" ви-доспецифічних нуклеотидних послідовностей у генетичному матеріалі патогену. Серед останніх слід згадати перш за все метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), який поки що малодоступний для більшості лабораторій та має поряд з іншими методами ще й певні недоліки (у більшості випадків, на відміну від класичного бактеріологічного ме­тоду, не характеризує ступінь патогенності - вірулентність збудника). Детальніше про молекулярно-генетичні методи студент дізнається під час вивчення дисципліни "Ветеринарна вірусологія".

Дослідження морфології мікроорганізмів можна здійснювати шля­хом мікроскопії (мікроскопічне дослідження).

Світлова мікроскопія. Серед світлових мікроскопів найбільш поширені прилади типів МБД (мікроскоп біологічний дослідницький), МБР (мікроскоп біологічний робочий; рис. 1) та "Біолам".

Більшість студентських лабораторій укомплектовано мікроскопами типу "Біолам". Промисловість випускає "Біолам" трьох серій: робочі -"Біолам-Р", студентські -"Біолам-С" та дорожні -"Біолам-Д". Студентські та робочі мікроскопи призначені для роботи в умовах лабораторії, дорож­ні - для роботи в експедиціях.

В мікроскопі розрізняють механічну та оптичну частини. До меха­нічної належать штатив, предметний столик, тубус, револьвер, мікро- та макрогвинти. Штатив складається з масивної нижньої частини - ніжки та верхньої - колонки.

Предметний столик може бути нерухомим ("Біолам"-С 1, -С₂, - та ін.), або рухомим (переміщується у двох взаємно перпендикулярних на­прямках горизонтальної площини "Біолам"-Р₅, Р₆). У деяких мікроскопах ("Біолам"-Р , Р₂ та ін.) предметний столик може обертатись навколо вертикальної осі.

Оптична частина світлових мікроскопів включає об'єктив, окуляр та освітлювальне пристосування.

Об'єктив - це система скляних лінз, вмонтованих у металевий ци­ліндр. Передня лінза називається фронтальною. Вона збільшує зображен­ня досліджуваного об'єкта. Решту лінз називають корегуючими. Вони виправляють зображення, одержане за допомогою фронтальної лінзи.

Всі лінзи мають дефекти сферичної та хроматичної абера­цій. Сферична аберація пов'язана з властивістю лінз нерівномірно переломлювати центральні та периферійні світлові промені. Останні, як правило, відхиляються значною мірою, тому перетинаються ближче до лінзи. При зображенні точка поширюється між місцями перетину периферійних та центральних променів і набуває вигляду розплив­частої плями. Явище хроматичної аберації виникає при проходженні через лінзу пучка променів, що ма­ють неоднакову довжину хвилі. По-різному переломлюючись, промені перетинаються у різних місцях. Ті, що мають меншу до­вжину хвилі, переломлюються сильніше. В результаті відбува­ється розкладання білого світла на спектр. Щоб ліквідувати дефекти, пов'язані зі сферичною та хро­матичною абераціями, застосо­вують коригувальні об'єктиви: ахромати, апохромати та план-хромати.

Ахромати - це об'єктиви, у яких неповністю виправлені сферична й хроматична аберації. Вони мають шість лінз. Чітке зо­браження об'єкта дослідження спостерігається у центрі поля зору. Краї поля зору досить час­то мають різні кольори спектра. Ахромати (найдешевші та кон­структивно прості) застосову­ються дуже часто. Більш складні у технічному відношенні апохромати. Вони мають 10—12 лінз, і в них повністю відсутні аберації.

Об'єктиви підрозділяють на сухі та імерсійні (заглиблені, олійні). Між фронтальною лінзою сухого об'єктива й об'єктом дослідження є прошарок повітря, а між фронтальною лінзою імерсійного об'єктива й об'єктом дослідження - шар імерсійної олії. Порівняно з сухими імер­сійні об'єктиви характеризуються кращою роздільною та збільшуючою здатністю. Підвищення збільшу­ючої здатності поєднується із на­ростанням кривизни фронтальної лінзи і зменшенням "корисної площі", що призводить до по­слаблення освітлення поля зору. У результаті зображення об'єкта дослідження стає нечітким.

Поліпшити освітленість поля зору в такій ситуації мож­на, запобігши втратам світлових променів у межах між об'єктом дослідження і фронтальною лінзою об'єктива. Для цього по­трібно створити оптично гомо­генне середовище. Цього можна досягти за допомогою імерсійної олії, зокрема, кедрової. Остання має коефіцієнт відхилення світ­лових променів майже такий, як і скло (я = 1,51 у кедрової олії і п = 1,52 у скла).

Світловий пучок, проходячи крізь шар олії, не розсіюється й забезпечує достатню освітле­ність поля зору. При відсутності імерсійної олії багато променів на межі скло - повітря відхиля­ються, і освітленість поля зору мікроскопа різко знижується (рис. 2). Якщо кедрової олії не­має, можна використати її за­мінники: персикову (п = 1,49) чи рицинову {п = 1,47) олію.

Імерсійні об'єктиви легко розпізнати. Вони мають спеці­альні символи - ОІ (об'єктив імерсійний), ОІ (олійна імерсія; у російському варіанті - МИ масляная иммерсия).

Окуляр складається з двох лінз, вмонтованих у металевий циліндр. Лінза, що повернута в бік дослідника, називається очною, а та, що у бік об'єкти­ва - збираючою. Збільшуюча характеристика окулярів порівняно з об'єктивами значно менша: 8 х > 10 х > 20 х.

Освітлювальний апарат (рис. 3) має дзеркало та конденсор з діа­фрагмою. З одного боку дзеркало плоске, з іншого - увігнуте. Плоским дзеркалом користуються при денному освітленні, увігнутим - при штучному.

Конденсор має дві скляні лінзи та ірисову діафрагму. Він концен­трує промені світла на об'єкті дослідження. Опускаючи конденсор можна зменшити, а піднімаючи - збільшити освітленість поля зору мікроскопа.

Ірисова діафрагма складається з напівкруглих металевих пластин, змінюючи положення яких можна регулювати діаметр отвору для світ­лових променів. На рисунку 4 наведено схему зображення об'єкта у світловому мікроскопі. Об'єктив О утворює у площині V перевернене зображення (Аі) об'єкта А Точка 2 знаходиться у фокусі окуляра Е, так що дослідник спостерігає збільшене уявне зображення А₂ у площині X, яке знаходиться на відстані 25 см від ока.

Основна функціональна характеристика мікроскопа - це збільшуюча та роздільна його здатність. Збільшуюча здатність відповідає збіль­шенню об'єктива, помноженому на збільшення окуляра. Наприклад, використовують об'єктив 90 х й окуляр 7 х. у цьому випадку загальне збільшення становитиме 630 (90 х 7).

Зображення об'єкта може бути чітким або розпливчастим, не­зважаючи на достатнє фокусування тощо. Це залежить від роздільної здатності мікроскопа - найменшої відстані між двома поруч розташо­ваними точками, коли останні ще не зливаються (дослідник бачить кожну з них окремо). Роздільна здатність ока людини становить близько 0,2 мм. Максимальна роздільність світлового мікроскопа - 150-200 нм (0,15-0,2 мкм).

Роздільну здатність мікроскопа визначають за формулою:

(і-мінімальна відстань між двома точками; А_/- цифрова апертура об'єктива; А — цифрова апертура конденсора, Я.-довжина світлової хви­лі (при денному освітленні беруть середній показник 0,55).

Таким чином, роздільна здатність мікроскопа прямо пропорційна сумі цифрових апертур об'єктива й конденсора і обернено пропорцій­на довжині хвилі світла, що використовується при мікроскопії. Отже, роздільну здатність приладу можна підвищити збільшенням цифрової апертури або зменшенням довжини світлової хвилі. Оскільки у звичай­них мікроскопах використовують денне світло (у = 0,55 мкм), роздільна здатність їх може бути підвищена лише шляхом збільшення цифрової апертури.

Цифрову апертуру (А) визначають множенням синуса половини (и) кута а на показник заломлення (п) середовища, що межує з лінзою:

А = 5Іпм п

З формули випливає, що цифрова апертура збільшується при зростанні показника заломлення променів (п). Відомо, що для повітря п дорівнює 1. При використанні імерсійної олії (п =1,51) цифрова апертура збільшується, що зумовлює підвищення роздільної здатності мікроскопа.

Цифрова апертура кожного об'єктива вказується на його оправі. Сухі системи мікроскопів серії "Біолам" 8 х та 40 х мають апертури відповідно 0,2 і 0,65, імерсійний об'єктив - 1,25.

Наведемо приклади розрахунку роздільної здатності мікроскопа "Біолам".

1. При використанні об'єктива 90 х (А1 = 1,25)

, 0,55 й „_г

а = = 0,25мкм

1,25 + 1

2. При використанні об'єктива 40 х (А 1=0,65)

0,55

а = = 0,34мкм

0,65 + 1

3. При використанні об'єктива 8 х (А1=0,20)

сі = = 0,46мкм

0,2 + 1

Техніка мікроскопування. Мікроскоп установлюють навпроти джерела світла (вікно, освітлювальний пристрій тощо). Конденсор під­німають у верхнє положення. Діафрагму відкривають.

Об'єктив малого збільшення встановлюють на відстані 1,5-2 см від предметного столика й, маніпулюючи дзеркалом, добиваються яскравого рівномірного освітлення поля зору.

Об'єкт дослідження (препарат) фіксують клемами. При малому збільшенні уточнюють розміщення необхідної ділянки препарату і на­носять краплю імерсійної олії. Поворотом револьвера встановлюють імерсійний об'єктив і за допомогою макрогвинта занурюють його у краплю олії до слабкого дотику фронтальної лінзи до предметного скла. При цьому дослідник повинен дивитись не в окуляр, а збоку. Після зану­рення об'єктив повільно піднімають, повертаючи макрогвинт "на себе" (дослідник дивиться в окуляр). При появі зображення за допомогою мікрогвинта, конденсора, діафрагми встановлюють оптимальну його контрастність. Розглядуваний препарат можна рухати по горизонтальній площині. Крапля імерсійної олії при цьому "повзе" і забезпечує оптично гомогенне середовище у необхідному місці.

Після закінчення мікроскопування піднімають тубус мікроскопа, марлевою чи фланелевою серветкою видаляють імерсійну олію з лінзи об'єктива. Іноді користуються серветкою, змоченою у бензині чи ксило­лі. В останньому випадку лінзу відразу протирають сухою серветкою.

Мікроскоп зберігають у спеціальному футлярі або під скляним ковпаком, щоб захистити його від пилу. При цьому револьвер повинен бути переведений на малий об'єктив. Останній трохи спускають на серветку, яку кладуть на предметний столик.

Окуляр, конденсор, дзеркала, предметний столик і інші деталі мікро­скопа періодично протирають сухою чистою серветкою.

У більшості сучасних дослідницьких мікроскопів використовують штучне освітлення. При цьому освітлювач може бути індивідуальним (ОІ-19) або вмонтованим у схему освітлювального пристрою (МБІ-2,6 та ін.). У першому випадку його встановлюють перед мікроскопом, вмикають в електромережу і за допомогою реостата, діафрагми та на­прямку світлових променів освітлювача, а також дзеркала діафрагми та конденсора мікроскопа знаходять оптимальний рівень освітленості поля зору.

Правильне освітлення об'єкта має дуже велике значення при до­слідженні, чого можна досягти, користуючись методом Келера, який включає такі положення: одержання чіткого відбитку джерела світла (спіраль лампи) та діафрагмі конденсора; одержання чіткого зображення ірисової діафрагми освітлювача у площині препарату.

Необхідні маніпуляції здійснюють у такому порядку.

1. Правильно встановлюють освітлювач відносно мікроскопа (на

спеціальну хрестовину).

2. На предметний столик кладуть препарат.

3. Встановлюють об'єктив 8 х.

4. Конденсор піднімають вгору до упору.

5. Діафрагму конденсора повністю відкривають.

6. Приймають матове скло.

7. Встановлюють плоске дзеркало.

8. Закривають діафрагму освітлювача, залишивши невеликий

отвір.

9. Вмикають освітлювач. Регулюють за допомогою реостата потік

світла так, щоб розжарювання лампи було слабким. Світловий потік повинен бути спрямованим у центр дзеркала. Цього дося­гають регулюванням зміни положення корпусу освітлювача.

10. На дзеркало мікроскопа кладуть шматок білого паперу і сфокусо-вують на нього зображення нитки розжарювання освітлювача.

11. Дивлячись в окуляр і обережно повертаючи дзеркало, знаходять у полі зору зображення країв діафрагми освітлювача (світла пляма з нечіткими контурами).

12. Сфокусовують препарат (об'єктив 8 х).

13. Легенько опускають конденсор, сфокусовують у площині пре­парату чітке зображення контуру діафрагми освітлювача.

14. За допомогою дзеркала одержану яскраву пляму приводять у центр поля зору. Рівномірного освітлення плями досягають обертанням дзеркала.

15. Діафрагму освітлювача відкривають так, щоб світла пляма за­йняла все поле зору.

16. Встановлюють об'єктив 40 х, сфокусовують об'єкт дослідження.

Інтенсивність освітлення можна регулювати лише зміною ін­тенсивності розжарювання лампи або застосуванням світлофільтрів. Положення дзеркала, конденсора та діафрагми освітлювача змінювати не можна. Діафрагмою конденсора можна користуватись лише для зміни контрастності зображення.

Мікроскопія у темному полі зору. Темнопольна мікроскопія дає змо­гу досліджувати об'єкти, невидимі у світлому полі мікроскопа, оскільки роздільна здатність при ній значно зростає (до 0,06-0,02 мкм).

При темнопольній мікроскопії об'єкт дослідження освітлюється косими променями. Такого освітлення досягають за допомогою спеці­ального конденсора.

Вітчизняна промисловість випускає конденсор темного поля 01-13 (рис. 5). При відсутності кон­денсора заводського виготовлення для темнопольної мікроскопії мож­на пристосувати світлопольний конденсор. З цією метою відкру­чують верхню лінзу конденсора, на центральну її частину кладуть кружечок чорного паперу й за­гвинчують верхню лінзу.

Темнопольний конденсор має затемнену середню частину, що запобігає проходженню цен- р_ис 5 Конденсор темного поля тральних променів. В результаті

поле зору мікроскопа залишається темним. Наявні в препараті бак­терії чи інші об'єкти освітлюються косими променями. Переломлені мікроскопічними структурами промені потрапляють в об'єктив. У результаті на фоні темного поля дослідник спостерігає об'єкти, що яскраво світяться.

Техніка мікроскопування. Темнопольна мікроскопія досить зручна при визначенні рухливості бактерій. З цією метою використовують молоду бульйонну культуру мікроорганізму, з якої роблять препарат "роздавлена крапля". Предметне скло повинно бути чистим, знежире­ним, тонким (товщиною не більше 1-2 мм).

Препарат кладуть на предметний столик мікроскопа й фокусують з об'єктивом 8 х. Потім послідовно виконують такі операції:

• звичайний конденсор змінюють на конденсор темного поля;

• відкривають (повністю) діафрагму і добиваються максимального освітлення вмиканням реостата;

• на верхню лінзу трохи опущеного конденсора наносять краплю імерсійної олії (допускається також нанесення дистильованої води);

• встановлюють препарат, зроблений за методом "роздавлена крапля";

• обережно піднімають конденсор доти, поки імерсійна рідина пошириться по нижній поверхні предметного скла;

• встановлюють мале збільшення й фокусують мікроскоп на пре­параті.

У полі зору повинна спостерігатись світла пляма (інколи з темним центром).

Регулювальними гвинтами конденсора центрують світлу пляму на середину поля зору, а інтенсивність її зображення регулюють підняттям чи опусканням конденсора. Після цього встановлюють об'єктив необ­хідного збільшення (найчастіше 40 х) і фокусують.

Фазово-контрастна мікроскопія. За допомогою звичайного світ­лового мікроскопа можна досліджувати лише висококонтрастні об'єкти, тобто ті, які порівняно з фоном інтенсивніше поглинають світлові хвилі, що йдуть від конденсора. Щоб підсилити цей ефект, об'єкти дослідження, як правило, фарбують. Такі об'єкти називають амплітудними. Іноді виникає необхідність досліджувати малоконтрастні об'єкти, тобто ті, що майже не змінюють, порівняно з фоном, потік світлових променів (у звичайному мікроскопі дослідник їх не бачить або лише відмічає ледь помітне зобра­ження). Неконтрастними є непофарбовані біологічні об'єкти (бактерії, клітини тощо). Вони не змінюють амплітуду світлових променів, що про­ходять крізь них, а здатні змінити лише фазу останніх (світлові промені, що проходять крізь щільніші ділянки препарату, дещо відстають за фазою від променів, які проходять поряд). Однак відомо, що людське око не В ЗМОЗІ помітити різницю між променями, які різняться лише за фазою.

З метою "перетворення" фазових об'єктів на амплітудні голланд­ський вчений Церніке (1934) запропонував спеціальну фазово-кон­трастну мікроскопію.

Промисловість випускає фазово-контрастний пристрій КФ-4, яким можна обладнати звичайний світловий мікроскоп і застосовувати фа­зово-контрастну мікроскопію. Він включає фазово-контрастний об'єк­тив, револьверний конденсор з діафрагмою, допоміжний мікроскоп. До оптичної системи фазово-контрастного пристрою входять фазова пластинка та кільцева діафрагма конденсора.

Фазова пластинка - це кружечок на одній із лінз об'єктива, на­пилений солями рідких металів. Пластинка напівпрозора, змінює фазу світлової хвилі на 1/4. Це й призводить до перетворення фазової різниці в амплітудну. Кільцева діафрагма - непрозора пластинка, яка має лише кільце, проникне для світлових променів.

З метою одержання фазово-контрастного ефекту необхідно, щоб кільце фазової пластинки точно збігалося з кільцевою діафрагмою конденсора (рис. 6).

Техніка користування фазово-контрастним пристроєм така:

1. Звичайний конденсор у світловому мікроскопі замінюють на фазово-контрастний. Диск револьвера мікроскопа повертають так, щоб у віконці з'явилась цифра "0".

2. Замінюють об'єктив 40 х на об'єктив 40 х ф (фазовий).

3. На предметний столик кладуть препарат (наприклад, "роздавле- на крапля" при дослідженні живих бактерій). Установлюють світло за Келером, користуючись об'єктивом 8 х.

4. Встановлюють об'єктив 40 х Ф.

5. Замінюють окуляр на допоміжний мікроскоп. Переміщуючи ту­бус мікроскопа, домагаються чіткого фокусування фазової пластинки об'єктива (має вигляд темного кільця).

6. Повернувши диск револьвера, вмикають кільцеву діафрагму, яка відповідає об'єктиву 40 х ф. При цьому з'являється не лише фазове кільце, а й кільце-щілина діафрагми.

7. За допомогою гвинтів для центрування зміщують кільцеву діа­фрагму таким чином, щоб вона збіглася з фазовим кільцем.

8. Допоміжний мікроскоп замінюють на окуляр і фокусують пре­парат.

Якщо мікроскопію здійснюють з використанням інших об'єктів, установлюють відповідні кільцеві діафрагми і щоразу проводять цен­трування, користуючись допоміжним мікроскопом.

Люмінесцентна мікроскопія. Люмінесценцією (від лат. lumen -світло) називають світіння об'єкта (речовина, жива істота), обумовлене наявністю надмірної енергії.

Люмінесценція може бути обумовлена багатьма джерелами енергії, зокрема короткими світловими хвилями ультрафіолетового (невидимий) або синього (видимий) спектра.

Розрізняють первинну і вторинну люмінесценцію. Первинна без­посередньо пов'язана з об'єктом спостереження, тобто речовинами, що входять до його складу. Вторинна зумовлена речовинами - люмі­нофорами, якими фарбують (флуорохромують) об'єкт дослідження. Як люмінофори широко використовують акридин оранжевий, акридин жовтий, примулин, флуоресцеїн, родамін та ін.

Залежно від тривалості люмінесцентного ефекту розрізняють флуоресценцію та фосфоресценцію. Флуоресценцією називають лю­мінесценцію, тривалість якої після усунення фактора, що її викликав, не перевищує 10"⁹ - 10"⁷ с. Більш тривалу люмінесценцію називають фосфоресценцією.

У практиці мікробіологічних досліджень явище люмінесценції використовується досить широко. За допомогою спеціальних при­ладів - люмінесцентних мікроскопів або люмінесцентних приставок до звичайних мікроскопів - можна спостерігати і вивчати бактерії, що світяться (люмінесценція). Оскільки останні мають незначну первинну люмінесценцію, їх спочатку обробляють (фарбують) люмінофорами.

Методика флуорохромування бактерій. 1. Готують мазок з буль­йонної чи агарової культури бактерій, який висушують на повітрі й фіксують (ацетон, етиловий спирт-ефір) протягом 10-15 хвилин.

2. Наносять розчин флуорохрому (наприклад, акридин оранжевий 1 : 10 000) на 1-5 хвилин.

3. Розчин флуорохрому зливають, мазок промивають дистильо­ваною водою, висушують фільтрувальним папером, досліджують за допомогою люмінесцентного мікроскопа.

Люмінесцентний мікроскоп вперше було сконструйовано у 1908 р. А. Келером і Т. Зідентопфом. Нині існує багато різних його модифікацій. Вітчизняна промисловість, зокрема, випускає люмінесцентні мікроскопи типу МЛ (1,2,3), "Люмам" (Р-1, Р-2, P-3, Д_р Д₂, Д₃) та ін. Практикується також випуск спеціальних пристроїв 01-17,01-28, 01-30, які у поєднанні зі звичайними світловими мікроскопами дають можливість вивчати люмінесціюючі об'єкти.

Прилади люмінесцентної мікроскопії включають:

• люмінесціюючий пристрій, основними елементами якого є джерело збуджуючої енергії (наприклад, лампа надвисокого тиску - джерело короткохвильових синіх та ультрафіолетових променів);

• освітлювальний пристрій (система, яка дозволяє позбавитись теплових променів та здійснити селекцію короткохвильових променів, що збуджують явище люмінесценції);

• світловий мікроскоп, оснащений замикаючим фільтром, який дає змогу збільшити об'єкт дослідження, "відсікти" шкідливі для зору дослідника ультрафіолетові та короткохвильові сині промені й забезпечити спостереження люмінесціюючого об'єкта.

На рисунку 7 зображено оптичну схему люмінесцентного мікро­скопа типу МЛ.

Як функціонує люмінесцентний мікроскоп? Джерело енергії (лампа надвисокого тиску) випромінює потік світлових хвиль, який за допомогою кварцевого колектора концентрується у щільний пучок і спрямовується в напрямку досліджуваного об'єкта. На шляху до ньо­го з пучка світлових хвиль вилучаються теплові (кювета з рідиною, теплозахисні світлофільтри) і селекціонуються короткохвильові про­мені (збуджуючий фільтр). Останні падають на об'єкт дослідження і зумовлюють його люмінесценцію. Об'єкт, що світиться, випромінює промені з більшою довжиною хвиль, ніж довжина хвиль збуджуючих променів (правило Стокса). За допомогою розділювальної пластини та замикаючого фільтра "відсікаються" шкідливі для людського ока короткохвильові промені, і дослідник має змогу спостерігати власну люмінесценцію об'єкта.

Правила роботи з люмінесцентним мікроскопом:

1. Люмінесцентний мікроскоп встановити у затемненій кімнаті або в кутку кімнати, де немає яскравого денного світла. Прилад повинен бути обов'язково заземлений.

2. Після вмикання мікроскопа необхідно почекати 10-15 хв., щоб джерело енергії набуло оптимального режиму функціонування.

3. Розмістити на предметному столику препарат, затиснути його клемами.

4. Нанести спеціальну нефлуоресціюючу олію, опустити в неї об'єктив.

Решта маніпуляцій ті ж самі, що й при звичайній світловій мікро­скопії. Після закінчення дослідження об'єкта мікроскоп вимикають з електричної мережі й після охолодження накривають футляром.

Електронна мікроскопія. У 1928 - 1931 рр. М. Кноллем і Є. Рускою було сконструйовано мікроскоп, що за принципом дії відрізнявся від за­пропонованих раніше. Замість пучка світла у ньому використовувався потік електронів, скляні лінзи було замінено на електромагнітні. Завдяки тому, що довжина хвилі електронного променя майже у мільйон разів менша за довжину хвилі світлового променя, роздільна здатність елек­тронних мікроскопів значно вища й становить близько 0,3-0,5 нм (3-5 Á), що дозволяє спостерігати об'єкти, невидимі у світловому мікроскопі.

Промисловість випускає ряд модифікацій електронних мікроскопів. Серед них найпоширенішими є просвічуючі та растрові. Сучасні ла­бораторії укомплектовано вітчизняними електронними мікроскопами: ЕМВ-100 Л, ЕМВ-100 ЛМ; ЕМВ-100 АК, ЕМВ-100 Б, ПЕМ-100 або при­ладами зарубіжних фірм JEM-100 В (Японія), BS-500 (Чехословаччина) тощо. Електронний мікроскоп має такі основні системи: оптичну, ва­куумну, енергопостачання. Крім того, є ряд додаткових пристосувань: системи охолодження лінз та нагріву пароолійних насосів, прилад для фотографування зображення та ін. Кожна із систем досить складна за конструкцією. Так, оптична система включає джерело електронів, електронно-оптичні лінзи, пристосування для корекції електронного мікроскопа просвічуючого типу (ЗМВ-100 Л). Джерелом електронів є катод (тоненька вольфрамова нитка, розігріта електричним струмом до 2500 °С (рис. 8). Потік електронів рухається у напрямку анода. При цьому частина їх потрапляє в отвір анода й формує пучок. Цей вузол приладу прийнято називати електронною гар­матою. Електрони рухаються лише в умовах вакууму. Для цього за допомогою спеціальних насосів (спочатку формвакуумних, а потім па-роолійного) із колонки мікроскопа відкачують повітря. Рівень вакууму при цьому повинен досягати 10"⁴ Па.

Потік електронів спочатку проходить через конденсорну лінзу, яка концентрує їх на об'єкті дослідження. Проходячи через останній, одна частина електронів поглинається або відхиля­ється, а інша, що залишилась, рухаючись у бік екрана, несе певну інформацію про досліджу­ваний об'єкт. При цьому пучок електронів по­слідовно проходить через об'єктивну, проміжну та проекційну лінзи, що сприяє збільшенню зображення.

Збільшувальна здатність мікроскопа за­лежить від швидкості руху електронів. З прискоренням його вона зростає. Швидкість електронів залежить від напруги, що подається на катод. У більшості сучасних мікроскопів використовується прискорювальна напруга 50, 75 та 100 кВ.

Збільшення досліджуваного об'єкта досягає 100 000 разів.

Зображення можна розглядати на флуорес­ціюючому екрані, а також можна сфотографува­ти, піднявши екран і забезпечивши доступ електронного пучка на фотографічну пластину. Об'єкти, які досліджують за допомогою електронного мікроскопа (бактерії, віруси тощо), наносять на спеціальні металеві сітки, отвори яких закрито тоненькою плівкою з колодію чи формвару. Для збільшення контрастності зображення об'єкти обробляють спеціальними розчинами (уранілацетат, фосфорно-вольфрамова кислота).

При дослідженні біологічних об'єктів надзвичайно зручні препарати у вигляді ультратонких зрізів. Бактерії, віруси або уражені ними тканини тваринного організму просочують спеціальними речовинами, які, поліме-ризуючись, починають тверднути, що дає змогу за допомогою спеціального приладу ультрамікротому одержати понадтонкі зрізи 10-20 нм (100— 200 А). Останні досліджують за допомогою електронного мікроскопа.