2. Иммобилизованные ферменты

Применение растворимых ферментов в различных отраслях промышленности и медицине ограничивается по ряду причин:

1. Трудная доступность чистых препаратов и их дороговизна.

1. Неустойчивость при хранении и при различных, особенно тепловых, воздействиях.

2. Невозможность многократного использования из-за сложности отделения фермента от реагентов и продуктов реакции.

Иммобилизованные ферменты - ферменты искусственно связанные с нерастворимым в воде носителем и сохраняющие частично или полностью свои каталитические свойства. Иммобилизованые ферменты хотя и стоят дорого, но лишены двух последних недостатков. Существенно упрощается отделение продуктов реакции от нерастворимого производного фермента, их можно удалить из реакционной среды простой фильтрацией. Кроме того, возникает возможность перевода многих периодических процессов на непрерывный режим при использовании колонок или проточных аппаратов с иммобилизованными ферментами, что сделало процессы более технологичными, резко повысилась эффективность использования ферментов.

Оказалось также, что связывание с носителем часто повышает термическую устойчивость ферментов. В случае протеаз иммобилизация существенно ослабляет взаимодействие между отдельными молекулами фермента, приводящее к самоперевариванию (автолиз). Решение проблемы иммобилизации приводит к коренной перестройке многих трудоемких химических производств, устраняет опасности, связанные с загрязнением окружающей среды и даже позволяет решить некоторые проблемы, связанные с нехваткой энергетических ресурсов.

Впервые иммобилизованные ферменты были получены Нельсоном и Гриффином в 1938 году. Они получили активный препарат -фруктофуранозидазы, сорбированной на активированном угле и на свежеосажденной окиси меди. В настоящее время в качестве носителей ферментов используются как неорганические вещества (кварц, каолин, фосфат кальция, селикогель, диатомиты), так и органические соединения (целлюлоза, декстран, агароза, КМЦ, сефадексы, белки, полистерол, ПААГ и др.).

Предложено большое число методов иммобилизации, основанных как на физической сорбции, так и на ковалентном присоединении белков к носителям. Одним из наиболее часто используемых химических приемов иммобилизации является обработка глутаровым альдегидом смеси фермента и полимерного носителя, содержащего NH₂-группу. При этом молекулы глутарового альдегида образуют основания Шиффа с аминогруппами белка (чаще с NH₂ - группой лизина) и носителя. К носителям, содержащим карбоксильные группы, фермент может быть присоединен путем обработки каким-либо растворимым в воде карбодиимидом, что приводит к образованию амидной связи с аминогруппой белка.

Если носитель связывается с аминокислотными остатками, располагающимися в близи активного центра фермента или даже в самом активном центре, иммобилизация может привести к частичной или полной потере каталитической активности. В целом значительная часть иммобилизованных молекул часто или полностью сохраняют способность катализировать ферментативное превращение или наблюдается лишь падение суммарной активности фермента.

Главным элементом технологической установки, в которой используются иммобилизованные ферменты является ферментный реактор, предназначенный для создания контакта между ферментом и субстратом в течение дос­таточно длительного для осуществления реакции врем­я, а также для отделения полученных продуктов от фермента. Существует несколько типов ферментных реакторов:

Реакторы периодического действия представляют собой большие, снабженные мешалками резервуары, в которые помещают фермент и субстрат. После прохождения реакции реактор опорожняют и продукты реакции отделяют от фермента. Если используют растворимый фермент, то его обычно удаляют путем денатурации (например, тепловой обработкой). Эта процедура экономически оправданна в случае применения дешевого фермента.

Проточные реакторы чаще представляют собой колонки, заполненные иммобилизованным ферментом (рисунок 1). В такой реактор можно непрерывно добавлять субстрат и удалять продукт реакции. Существует несколько видов таких реакторов:

1. Проточный перемешиваемый реактор (ПП-реактор) состоит из резервуара, оборудованного мешалкой (магнитной или подвесной), и имеющего отдельные отверстия для добавления субстра­та и отведения реакционной смеси. Правильно подобрав размеры резервуара, активность фермента и скорость добавления субстрата, можно добиться желаемой глубины превращения субстрата в продукт.

2. Реактор с неподвижным слоем (реактор с вытеснением) - реактор, в котором жидкость протекает через всю площадь поперечного сечения колонки (сверху или снизу) с одинаковой скоростью. Фермент иммобилизуют на мембранах или каком-либо листовом материале и помещают в колонку, через которую продавливают раствор субстрата.

3. Реактор со взвешенным слоем заполняется частицами с иммобилизованным -ферментом, раствор субстрата подается снизу с достаточно высокой скоростью, в результате происходит поднятие и перемешивание частиц внутри колонки.

Рис. 1. Типы проточных ферментных реакторов.